[发明专利]大熊猫全基因组DNA提取方法

说明书

本发明涉及DNA基因提取方法，特别是涉及一种大熊猫全基因组DNA提取方法。

目前国内外对动物的福尔马林和石蜡包埋器官组织，陈旧标本皮肤等材料的DNA提取，仅仅能得到1.0kb左右的DNA碎片，用于PCR分析，不能获得动物的全基因组DNA，进行Soutliern印迹、基因组分析和克隆等方面的研究。与此同时，利用乙醇固定器官组织、新鲜粪便和尿液、乙醇或福尔马林固定粪便等材料提取动物胃肠道上皮脱落组织细胞全基因组DNA的研究末见报道。近年来，国内外对于大熊猫DNA的分析研究正在逐步开展起来，但研究材料均取自于大熊猫的新鲜血液、精液、皮肤及毛发。基于大相岭、小相岭两个山系的大熊猫，目前仅有部分个体生活在野外，而岷山、凉山、邛崃和秦岭等四大山系的大熊猫，虽有部分个体生活在自然保护区饲养场，动物园和大熊猫繁育研究基地，但因个体数量少，以及出于保护珍稀濒危动物等诸多原因，若以新鲜或冷冻的血液、精液、皮肤等组织为DNA材料来源，则极其困难，因此，以标本馆和实验室中大熊猫的福尔马林或乙醇固定器官组织、石蜡包埋组织、陈旧标本皮肤、甚至野外或圈养大熊猫的新鲜粪便、尿液、福尔马林或乙醇固定粪便等为DNA材料来源，将是解决大熊猫DNA分析研究中实验材料难以获得的新途径。

本发明的目的在于提供一种可为大熊猫的新鲜粪便或尿液，福尔马林固定器官组织或固定粪便，乙醇固定器官组织或粪便，石蜡包埋器官组织和陈旧标本皮肤等样品为分析材料的大熊猫全基因组DNA提取方法。

本发明大熊猫全基因组DNA提取方法是：

1)在大熊猫全基因组DNA提取材料(新鲜粪便、火盆烘烤粪便、福尔马林固定粪便、乙醇固定粪便、尿液、福尔马林固定器官组织、乙醇固定器官组织、石蜡包埋器官组织、陈旧标本皮肤)中按1∶1的比例加入80％乙醇，室温静置0.5小时，3000转/分离心5分钟，分离，取沉淀。但当DNA提取材料是粪便和尿液时，应进行两次离心分离，即加入80％乙醇，室温静置0.5小时，3000转/分离心5分钟，分离后，先取上层清液，目的是除去粪渣，再将上层清液再次4000转/分离心5分钟，分离，病毒和细菌固定在上层清液中，不再产生酶分解大熊猫DNA，弃上层清液，最后取沉淀。

2)在1)所得沉淀中加入90％乙醇，室温静置0.5小时，3000转/分离心10分钟，分离，取沉淀。

3)在2)所得沉淀中加入100％乙醇，室温静置0.5小时，3000转/分离心10分钟，分离，取沉淀。

4)将3)所得沉淀入滤纸袋内，封口，放入临界点干燥器样品室，由钢瓶加入液态二氧化碳，至液态二氧化碳液面超过纸袋最高点为止。

5)样品室加温至31℃(大气压72.8)后，维持两小时，打开放气阀门，排出气体，同时彻底除去福尔马林和乙醇，取出纸袋，得纯干燥样品。

6)将纸袋内样品放入研钵内，加入液氮，0.2分钟后样品冰冻变脆，研为粉末，按1∶1比例加入TNE缓冲液，移入离心管内，加入蛋白酶K和SDS，使终浓度分别为50mg/l和0.5％(重量)，于55℃保温消化3小时。

7)用重蒸苯酚提抽2次，除去蛋白质和细菌，再用氯仿提抽一次，除去苯酚，加95％冷乙醇(-10℃)沉淀，用大口吸管吸出大熊猫全基因组DNA，真空干燥1小时，于4℃下保存备用。

本发明大熊猫全基因组DNA提取方法的优点在于全基因组DNA提取材料可为新鲜粪便、火盆烘烤粪便、福尔马林固定粪便、乙醇固定粪便、尿液、福尔马林固定器官组织、乙醇固定器官组织、石蜡包埋器官组织、陈旧标本皮肤等，该DNA能用于大熊猫基因指纹分析，同时也用于脊椎动物(鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类)和人类分子生物学应用与基础研究中，如认定动物数量、家系结构组成、性别结构、交配行为等，由此获得种群的群体遗传学定量资料，为野生动物的动态管理，建立唯一且是定量的分子遗传学档案；研究已绝灭、或濒于绝灭动物的进化生物学、分子遗传学；在医学上，对于一些以往不能确诊的疑难病症的乙醇或福尔马林固定检材，可用此法提取全基因组DNA，进行基因分析与诊断；另外，在法庭科学应用中，利用此技术方法，从嫌疑人现场微量检材中，提取全基因组DNA，通过基因指纹探针作指纹检测，认定罪犯。

下面详细说明本发明实施例。