[发明专利]银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立

说明书

本发明公开了一种银杏发根的转化及其无性繁殖系的建立，开辟了一个再生银杏资源的新途径，为用银杏发根生产天然药物提供了可能。本发明技术属生物技术领域，也属医药技术领域。

银杏(Ginkgo bilobaL.)是我国特有的、多用途的珍贵树种。银杏资源特别是银杏叶片的开发国内外均逐渐产业化，此乃是银杏及其制剂有很高的药用价值所致。如银杏黄酮有抗自由基，抑制脂质过氧化，降血脂和增加脑血流量的作用；银杏内酯是特异的血小板活化因子(PFA)拮抗剂。银杏叶片提取物制剂对于脑功能障碍，智力功能衰退，降低血清胆固醇，增加冠状动脉血流量，改善脑营养，有很好的保健作用。在治疗心血管，脑血管，抗衰老，抗痴呆等疾病中，具有目前其它药物难于替代和难于达到的功效，而且无任何副作用。研究表明，银杏内酯在治疗哮喘，内毒素休克，器官移植排异反应及多种炎症方面均有潜在应用价值；此外，还有白果内酯，聚异戊烯醇等成分都是十分珍贵的药用资源。银杏提取物不仅可做药品，还可制成保健品，食品及化妆品(刘桂霞等：国外医药》。植物药分册，1994年第9卷第一期，10～14)。

目前，国内外主要是从银杏叶片中提取银杏黄酮和银杏苦内酯等有效成分。但天然资源受气候的影响，季节性强，病虫害及霉变的侵扰都会影响银杏叶的产量和质量；扩大银杏种植，必定与粮争地，而我国的土地资源十分有限；从提取工艺来说，银杏叶的工艺提取环节多，费时费力成本高等，而且各地银杏叶的品质(即有效成分的含量)又有差异。

近些年来，随着生物技术的发展，韩国，日本，加拿大等国科学家开始了银杏细胞悬浮培养的研究，有的还申请了专利(Hah-Dok Remedia Ind.Co.LTD.KR/KR，WO93/02204，1993.2.4.)。据悉这方面的研究已引起美国，澳大利亚，德国，法国等国科学家的重视。这是因为：第一，天然银杏资源毕竟有限，并有其固有的缺陷；第二，银杏中含有无法替代的、特效的、高经济价值的药用成分；第三，时至今日，将生物技术应用于银杏上是顺理成章的事情。

本发明的目的是：为了克服人工种植银杏树的局限性，如生长周期长、一年只能采收一次、受气候及病虫害影响大，质量不稳定以及提取工艺较复杂等：为了克服培养细胞生长速度慢，遗传上不够稳定及培养较复杂等；利用银杏发根培养技术提取银杏天然药物。在多年研究工作积累的基础上，考虑到生物技术作为二十一世纪高技术的核心地位，我们拟用Ri质粒转化银杏，目前国内外均未见转化银杏发根成功的报道。

为实现本发明所采取的技术措施是：

本发明以银杏叶片或根皮等外植体为材料，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒的T-DNA整合到银杏外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，也称之为发根(hairy root)；每一根发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起银杏发根悬浮培养无性繁殖系。具体步骤如下：

1材料：

取新鲜、健康富含银杏黄酮和银杏内酯的银杏叶片或根皮和已有的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株：pRil5834，pRiA4，R1000等。

2转化：

(1)发根农杆菌的活化：将各菌株先后在酵母牛肉膏(YEB)固体或液体培养液中，26±1℃下，于暗中活化2～3次，每次培养16～24h；

(2)外植体灭菌：取当年银杏叶片或根皮，洗净，切成0.5cm²小块或0.5×1.0cm小段，用0.1％升汞灭菌10分钟，无菌水冲洗三次，每次不少于5分钟，然后吸干表面水分；

(3)感染：将灭菌后的银杏叶片或根皮段外植体，浸入活化后的发根农杆菌菌液(1×10⁷～10^-8个/ml)内，感染20min～2h。因银杏是古老的裸子植物，在分类上单科单属单种，遗传上十分保守，不易为发根农杆菌所感染，为提高感染和转化频率，我们附加了不包括银杏的植物发根浸出液，及某些二价金属离子等，感染毕，用无菌蒸馏水冲洗五次，以去除表面多余菌液，最后吸干表面水分。

(4)将感染后银杏的叶片或根皮放入无激素含抗菌素的1/2～1/4MS(系用该培养基配方发明人Murashige和Skoog两人名字字头命名，国际通用)固体培养基上，25±1℃，暗中或散射光下培养。大约20～50天即可陆续诱导出发根。

3培养：

(1)切割下外植体上长出的发根，置于1/2～1/4MS无激素培养基上培养并繁殖3～5代，10～20天继代一次；