[发明专利]培养有甲醇代谢途径的微生物的方法

说明书

发明背景

1  发明领域

本发明涉及培养含有已经导入到一表达单位中的甲醇代谢途径的微生物的方法，在所述表达单位中，靶基因连在能够由甲醇诱导的启动子下游，所述方法能够有效地生产靶基因产物。

2  相关领域

由于重组DNA技术的发展，用微生物作为宿主生产多肽和其它基因产物显然已成为可能。多肽生产是通过导入表达单位来完成的，在所述的表达单位中，靶多肽的基因连在适宜启动子的下游。通常用微生物，如大肠杆菌，酵母和动物细胞作为宿主。

用大肠杆菌作为宿主的基因表达系统是最常用的系统，而且这些系统通常可以提供高产率。但是，在许多情况下，表达的多肽形成产生不可溶形式的不可溶的包含体，所以使用所述系统的可能性取决于靶多肽的特性。

另一方面，由于在许多情况下，表达的多肽保持了活性，所以用动物细胞作为宿主的基因表达系统对于确定基因产物的活性等目的是有用的。然而，靶多肽的量通常很低，而且在所述情况下，还需要进行纯化。另外，由于动物细胞的繁殖慢，而且所用的培养基很贵，培养既费时又费钱。此外，也很难提高培养规模。因此动物细胞不适宜作为宿主用于以大体积工业上得到靶多肽。

酵母细胞是有内质网，高尔基体和其它与动物细胞相似的细胞组分的真核细胞。还已知在从真核细胞衍生的多肽中，它们能够形成并表达具有特定三维结构的多肽。另外，它们的繁殖比动物细胞快，而且容易大体积培养。已经对酿酒酵母进行了广泛的遗传分析，广泛地用其在实验室水平作为基因表达的宿主。

然而，由于很难使酿酒酵母生长到较高的细胞密度，而且每培养基的产率不高，因此不足以用于工业化生产靶多肽。为了解决这一问题，使用巴斯德毕赤氏酵母，多形汉逊酵母和博伊丁氏假丝酵母。

例如，Gellissen等人用其表达受甲醇诱导的甲酸脱氢酶启动子和多形汉逊酵母为宿主，以每升培养基100-130干细胞重的细胞密度生产了1.4g葡糖淀粉酶(Gellissen等人，生物/技术，9，291-295，1991)。另外，Barr等人用其表达受甲醇诱导的醇氧化酶启动子和巴斯德毕赤氏酵母为宿主，每升培养基生产了4g人血清白蛋白(Barr等人，药物学工程，12(2)，48-51，1992)。

但是，甚至在使用甲基营养型酵母的情况下，上述问题仍可能得不到解决。在具有甲醇代谢途径的酵母的情况下，在使用以上述三种甲基营养型酵母为代表的酵母和能够由甲醇诱导的启动子的异源基因表达系统中，当在含甲醇的培养基中培养酵母时，培养基中的甲醇迅速减少。在这种培养中，必须用甲醇作为碳源以同时保持从启动子开始的转录和细胞生长。

但是，如果在甲醇供应过程中，甲醇在培养基中的浓度突然增加，就会杀死酵母。另外，通常通过对上清液进行气相层析等来测量在有甲醇代谢途径的酵母培养物中的甲醇浓度。但用所述方法，除需要特定的装置外，由于需要很长的时间才能确定甲醇的浓度，所以不利于迅速判断是否需要再补充甲醇。

作为用于在表达靶基因的培养基中保持甲醇浓度的方法的实例，一种方法是使用降低甲醇消耗速率的酵母，在所述酵母中，从其代谢途径中除去了醇氧化酶。所述方法包括用甘油等作为碳源，使酵母生长，然后通过将固定量的甲醇加到培养基中来诱导从启动子开始转录以表达所述靶基因。由于甲醇的消耗速率低，所以很容易保持甲醇浓度。尽管可以得到稳定的培养，但该方法的缺点是由于是针对细胞生长期和靶基因表达期分别进行培养，所以需要较长的培养时间。

在WO 95/21928中公开了一种方法，其中将培养基中的甲醇浓度控制在恒定的水平以便通过培养甲基营养型酵母来表达靶基因，在所述酵母中，通过部分改变代谢途径的酶而减慢了甲醇代谢，但未增加细胞数量。所述方法包括在一种状态下，测量培养罐内空气中的甲醇浓度，其中培养罐内空气中的甲醇浓度反映了培养基中的甲醇浓度，然后从那些结果得到甲醇增加的速率以便控制培养基中的甲醇浓度。

通过该方法，可以将醇氧化酶基因缺陷型的甲基营养型酵母培养基中的甲醇浓度控制在恒定的水平。然而，为了从培养罐内空气中的甲醇浓度预测培养基中的甲醇浓度，需要两者是平衡的。为了达到这种平衡，包括通气速率，压力和温度的培养条件必须保持稳定，而且不能突然改变培养基中的甲醇浓度。由于这些限制，只能将用于控制甲醇浓度的上述方法用于事先使用酵母使细胞生长后的基因表达诱导期，所述酵母没有甲醇代谢途径。