[发明专利]分泌型Kex衍生物的制造方法

说明书

本发明是关于具有Kex2蛋白酶活性、在培养液中大量地分泌的Kex2衍生物及其制造方法。进而是关于上述分泌型Kex2衍生物的利用方法。

正在尝试利用许多嵌合蛋白质表达法生产生理活性肽的方法，作为目的肽的游离法，正在使用化学的或酶的切断法。作为化学的方法，有利用亚硝酸的天冬氨酸残基开裂、利用CNBr的甲硫氨酸残基开裂(Itakuraet al.，Science 198，1059，1977)。然而，该方法不能避免目的肽的修饰，也有精制成本的问题。

在酶的方法中，使用将赖氨酸的C末端侧的肽键特异地切断的赖氨酰肽链内切酶(无色杆菌蛋白酶-I)，及使用将谷氨酸的C末端侧的肽键特异地切断的葡萄球菌蛋白酶V8(特公开6-87788)。然而，上述的化学的方法和内蛋白酶为了识别一个氨基酸残基，为了有效地从嵌合蛋白质切出目的肽，前提是在目的肽中不包含这些氨基酸残基，限定能生产的肽。为此，要求识别数个氨基酸残基的通用性高的切断方法。

前激素转化酶是在生物体内从其前体生成肽激素的酶，即使在体外作为用于从蛋白质切出肽激素的酶，也期待保持所希望的性质。Kex2蛋白酶是以来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的激素转化酶，异常地切断Lys-Arg、Arg-Arg、Pro-Arg序列的C末端侧的肽键的钙依存性丝氨酸蛋白酶。Kex2蛋白酶是由在N末端侧保持信息序列、在C末端侧保持疏水性氨基酸连续的膜贯通领域的814个氨基酸残基组成的蛋白质，在细胞内局部存在于转移高尔基体。

再者，在序列表·序列号1中示出编码Kex2蛋白酶的碱基序列及对应的氨基酸序列。缺失以啤酒糖酵母作为宿主的C末端区域的Kex2衍生物的基因表达及其解析的结果表明，具有从序列号1的氨基酸序列1至614的氨基酸序列的Kex2衍生物保持Kex2蛋白酶活性，在培养液中分泌出(Fuller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，86，1434-1438，1989；特开平1-199578)。在本说明书中，根据从序列号1的氨基酸序列1开始的氨基酸数表示为Kex2蛋白酶衍生物。即具有从序列号1的氨基酸序列1至614的氨基酸序列的Kex2衍生物表记为Kex2-614。

迄今，在已研讨过分泌生产的Kex2衍生物中存在SS-Kex2和Kex2ΔP。

SS-Kex2是在Kex2-614中附加氨基酸残基的肽的Kex2衍生物，研讨了以啤酒糖酵母作为宿主的生产(Brnner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，922-926，1992)。在宿主中用蛋白酶缺失株(pep24)进行表达(4mg/L培养液)，从培养上清液以精制效率20％进行精制，精制过的SS-Kex2，因为经Asn型糖链分解酶BndoH处理后分子量降低，所以暗示带有Asn型糖链。进而也研究了使用合成底物的酶活性的pH依存性的底物特异性。

Kex2ΔP在本发明书中是表示为Kex2的Kex2衍生物，以昆虫细胞sf9作为宿主研究生产条件，已知道活性的90％在培养上清液中分泌，并且分泌的Kex2Δp的分子量是70KDa，比在细胞内的分子量120KDa要小(Gerain et al.，Eur.J.Biochem，204，121-126，1992)。进而，在表达Kex2的培养上清液中也看到分子量70KDa的蛋白质，并且，如果用丙氨酸残基取代Kex2Δp的385号的丝氨酸残基(Kex2蛋白酶活性的催化部分)，在培养上清液中看到的Kex2Δp的分子量与细胞内的分子量是相同的120KDa，因此70KDa的蛋白质被认为是在培养液中C末端部分缺失了Kex2Δp(120KDa)的自分解物。进而还尝试将从分解物的分子量和Kex2蛋白酶的底物特异性预想的切断部位Lys-Arg序列(序列号1，氨基酸序列号503-504号)转变成Lys-Len序列的衍生物Kex2Δ504的表达。可是，在此场合在培养液中也看到70KDa的蛋白质，Kex2Δp在自分解时不一定切断从合成底物预想的Lys-Arg序列，并且，成为Kex2蛋白酶的识别部位的这种序列在别处不存在，因此Kex2Δ504识别与从合成底物预想的序列完全不同的序列，暗示切断自己的可能性。

如上所述，关于Kex2衍生物虽然进行了使用合成底物的底物特异性的研究，但还不清楚使用蛋白质场合的底物特异性。另外，也没有有关各种Kex2衍生物的分泌产量的见解，也不清楚能否稳定地分泌生产除Kex2-614以外的Kex2衍生物。