[发明专利]癌胚抗原基因启动子DNA的克隆方法、序列及其用途

说明书

本发明涉及人癌胚抗原(CEA)基因启动子DNA的克隆方法，及该CEA特异启动子DNA的核苷酸排列顺序、用途。属于医学基因工程技术领域。

使用自杀基因(HSV-TK基因)、抗癌基因、细胞凋亡基因治疗肿瘤是当前肿瘤治疗研究的新进展，虽然在临床上已取得一定的疗效(CulverRW et al:Gene therapy for the treament of malignantbrain tumors with in vivo tumor transduction with the herpessiwplexthymidine kinase gene/gancidovir system.Hunan Genefherapy 1994；5:3431)，但单纯上述基因的应用，缺乏肿瘤的特异性，限制了基因治疗在临床上的应用范围及治疗效果。

癌胚抗原(CEA)是人胚胎时期的一种血清蛋白，主要是由胚胎大肠上皮细胞分泌产生的。在成熟期大肠上皮细胞已经失去了分泌癌胚抗原蛋白的功能，但在部分大肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤患者，癌胚抗原蛋白发生异常表达(Boring C S,et al:Cancer stati-stics.CA-Cancer Journal-for Clinians,42:19-38,1992)。自1965年发现CEA以来(Gold P and Fredman S O:Specific carcino-embryonic antigen of the human digestive systen,J Exp Ked,122:467,1965),CEA已成为世界上研究最为广泛的肿瘤相关抗原，它不仅常规用于临床CEA分泌性肿瘤的诊断、鉴别诊断与疗效和预后的评价，最近资料还显示CEA是人类肿瘤特异性主动免疫治疗中最有希望的靶抗原。目前已经确定癌胚抗原基因的表达受到其上游的启动子的调控，相信在CEA分泌性肿瘤中，与CEA表达有关的一些因子的异常表达重新激活了CEA基因的启动子，故有CEA的异常表达。为开展CEA分泌性肿瘤特异基因治疗，国外从结肠癌细胞克隆出CEA基因启动子DMA，将其与治疗基因连接，使治疗基因特异性地只在肿瘤细胞中定位表达，达到选择性杀伤肿瘤细胞，而正常细胞不受影响的治疗效果。如CEA启动子基因与HSV-TK基因连接，使TK基因只在CEA分泌性肺癌(腺癌)细胞中表达，在非CEA分泌性细胞不表达，使肺癌细胞对药物GCV的敏感性提高了1000倍(Oski T et al:Gene therapy for carcinoembr-yoincantigen-producing human lungcacer cells by cell type-specificexpression of herpes siwplex virus thymidine kinasegene.CancerRes.54,5258,1994)，为肿瘤基因治疗带来新的前景。

本发明的目的是提供一种人胃癌CEA基因启动子DNA克隆方法、胃癌CEA特异启动子DNA的核苷酸排列顺序。其特点是：该DNA序列具有癌胚抗原基因启动子活性必须序列，同时与结肠癌CEA基因启动子不同，在+93位是C而不是G碱基(Schreme H et al.Nol Cell Biol,1990；10:2738；Richards CA et al.Hum Gene Ther 1995；6:881-93)；该DNA克隆作为一种大肠杆菌质粒，可在大肠杆菌大量扩增，经简单纯化，使用特意设计并连接在该基因克隆DNA两端的不同酶切位点酶切，即可将其切下，并可定向插入新的基因治疗用载体。在该段DNA调控下，外源基因只能在表达CEA的肿瘤细胞才发生表达，为CEA分泌性胃癌等肿瘤的特异性基因治疗提供一个新的基因元件。

本发明的人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA克隆载体pCEAp(寄存于大肠杆菌JN109株，含该质粒的菌种命名为Eschertchia coli JN109/pCEAp，已于1997年9月11日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册号为CCNCC No:0324)见图1，由以下DNA元件组成：

1、CEA分泌性肿瘤细胞表达的特异启动子--癌胚抗原基因上游调控序列；

2、大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰氨酶基因)--质粒pGEM-3zf(+)。

本发明用于构建人胃癌癌胚抗原基因启动子DNA克隆的主要细胞株和原始质粒是：

pGEN-3zf(+)：源自华美公司。