[发明专利]用于基因治疗的含杂交启动子的核酸构建体

说明书

本申请涉及可以用于基因操作，特别是用于疾病预防或治疗(下文称为基因治疗)的核酸构建体。在基因治疗中，有待在有机体中表达的基因被引入到有机体中。这些基因表达的调节对基因治疗的预防和治疗效果有重要意义。

专利申请PCT/GB95/02000、PCT/EP95/03370、PCT/EP95/03371、PCT/EP95/03368和PCT/EP95/03339描述了基因表达的调节物。这些调节物包括激活物序列，其功能是，例如，细胞特异性或病毒特异性地激活基础转录。此激活物序列的DNA序列通过其3′末端和启动子组件的5′末端连接。接着结构基因通过其5′末端和此启动子组件的3′末端连接。

启动子组件由结合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族之转录因子的核酸序列组成。在细胞周期的G0和G1期，这种结合导致上游激活物序列的抑制，结果使位于下游(即在转录方向上)的结构基因抑制或者转录。

在细胞分裂的G0和G1期，细胞含有的DNA以二倍体状态存在。在G0期，细胞处于静止状态，而在G1期，其细胞周期进程受到抑制。G1期之后是S期，此期发生DNA合成并且基因组复制。然后是G2期，此期细胞处于四倍体状态。G2期之后是细胞分裂期(有丝分裂＝M期)。然后子代细胞进入G0状态和G1状态。

在G0和G1期，细胞特异性或者病毒特异性的激活物序列和抑制激活物序列的启动子组件组合使以细胞特异性或者病毒特异性以及细胞周期特异性(即局限于S和G2期)的方式调节结构基因的表达成为可能。

激活物序列和启动子组件的组合体被称为嵌合启动子。嵌合启动子在基因治疗上有很多可能的应用，但由子其缺点也有很多限制：

这些限制的例子是：

—引起结构基因极低水平转录的弱激活物序列，

—在完全依靠细胞周期的方式中，不能被选择的启动子组件抑制的激活物序列的使用，

—对两种结构基因转录调节物(例如细胞特异性或病毒特异性和细胞周期特异性)的限制，

—已经导入细胞中的结构基因之转录产物的不充分胞内运输。

本发明通过提供本发明的核酸构建体，克服了利用已知嵌合启动子表达外源基因的这些弱点，这些核酸构建体使得可以在宿主细胞中调节外源基因的表达。

本发明的目的是使得可以获得能够在宿主细胞中以精确的方式调节外源基因(转基因)表达的核酸构建体。因此，本发明涉及核酸构建体，其中通过至少一种显示出第一突变(这种突变抑制转基因的正常表达)的核酸序列来完成转基因的精确调节，另外，其中至少另一种核酸序列显示出第二突变，这种突变消除(abolish)第一核酸序列(S)中由于突变而产生的抑制作用。

具体地说，本发明的核酸构建体通过利用可变(alternative)构建体调节宿主细胞中的转基因表达。当含有第一突变的核酸序列是转基因(b)(这种转基因包含抑制所说的转基因转录和/或翻译或者抑制药理活性化合物功能的突变)时，这种核酸构建体还包含定位于转基因5′末端的第一启动子或增强子序列(a)；或者，当含有第一突变的核酸序列是第一启动子或增强子序列(a′)(其包含抑制第一启动子功能的突变)时，核酸构建体还包含编码药理活性化合物的转基因(b′)。另外，至少一种包含第二突变的核酸序列消除由于第一突变而引起的抑制作用。

这些核苷酸序列在相同或不同启动子序列控制之下，因此转基因只有在所有启动子序列都被激活的情况下才能表达。

优选的是，新核酸构建体在5′末端至3′末端方向的阅读框架中，包含至少下列组件：

第一(I)启动子或者增强子序列(a)，其是非特异性的、细胞特异性或病毒特异性的，或者其可以被四环素或代谢性地和/或细胞周期特异性地激活，其激活转基因的转录并且包含抑制此启动子功能的突变(a′)，

作为结构基因的转基因(b′)，这种转基因编码活性化合物并且可能包含终止结构基因转录和/或翻译或者抑制结构基因产物功能的突变，

第二(II)启动子或者增强子序列(C)或(C′)，这种序列是非特异性的、细胞特异性或者病毒特异性的，或者其可以被代谢性地和/或细胞周期特异性地激活，其激活组件(d)或(d′)的基础转录并且包含抑制此启动子功能的突变，

用于消除(relieve)一种或多种启动子或者转基因中的突变的tRNA(抑制基因tRNA)或者调节蛋白质(d)或者(d′)的基因。