[发明专利]抗凝血酶－III的生产方法纯化方法及含该酶的制剂

说明书

发明领域

本发明涉及抗凝血酶-III的生产方法，纯化方法及含该酶的制剂。具体而言，本发明涉及用于治疗各种疾病的抗凝血酶-III的生产和纯化方法以及含有如此制备和纯化的抗凝血酶-III的制剂，其中所述疾病例如是由体内抗凝血酶-III的可利用度降低造成的。

发明背景

抗凝血酶-III(此后称为“AT-III”)是一种属α₂球蛋白的糖蛋白存在于血浆中。AT-III分子量为65,000至68,000，具有蛋白酶抑制活性。AT-III能强烈地抑制凝血酶的凝血活性。

此外，AT-III不仅对凝血酶具有抑制活性，而且对其他凝血因子如活化的因子X和活化的因子IX也具有抑制活性。另据报道，AT-III还对血纤维蛋白溶酶和胰蛋白酶具有抑制活性。

这些抑制活性通常在肝素共存情况下更为快速。

具有这些活性的AT-III已被用于治疗异常的凝固性过高、特别是散布性血管内血凝固(DIC)及由于AT-III可利用度降低引起的各种其他疾病。

另外，AT-III对肝素具有亲和性，已报道了多种纯化方法，其中基于这种亲和性，使用了固定化肝素(如JP-A-63-23896；这里所用的术语“JP-A”是指“未审公开日本专利申请”)。

并且，由于AT-III是一种存在于血浆中的蛋白质，当它被用作一种治疗剂时，需要对其中潜在的病毒灭活。

在这些病毒灭活处理中，一个具体的已知例子是在60℃液态热处理10小时。但是，据报道AT-III在PH6至8时是稳定的，而在56℃热处理6小时会丧失80％的活性(J.Biol.chem(生物化学杂志)，246：3694(1971))，另一方面，有许多报道中指出，当在14.7w/v％的柠檬酸钠存在下，将AT-III在60℃进行液态热处理10小时，AT-III的活性能稳定保持(Thrombosis Research(血栓研究)，22：233(1981)和J.Biol.chem，.256：12140(1981))。然而，当在0.35至1.5M(10.29至44.12w/v％)柠檬酸钠存在下将AT-III在液体中加热时，通过免疫电泳分析观察到AT-III的变性(Vox Sang，48：325(1985))。

由于这种病毒灭活处理也会产生变性蛋白，如灭活的AT-III，聚合蛋白或上述类似蛋白等，所以，例如通过再次进行固定化肝素处理(JP-A-63-23896)或进行疏水性色谱法处理(JP-A-1-275600)以清除这类杂质的方法已有报道。然而，固定化肝素处理即使仅进行一次也会导致低的活性回收率，并且，疏水性色谱处理具有遗留污染蛋白的可能性，象前清蛋白、转铁蛋白、IgG等等，这样则必须再次进行纯化步骤以除去这些蛋白，由此活性回收率会降低。

发明概述

本发明的一个目的是提供医学治疗中适用的AT-III的生产方法，当AT-III在液态中被加热时，稳定保持AT-III的活性并且减少AT-III的变性(构象变化，诸如二聚作用、聚合作用等等)。

此外，本发明的另一个目的是提供除去污染物蛋白诸如灭活AT-III等等的一步法，同时并保持AT-III的活性。

换句话说，本发明涉及一种AT-III的生产方法、纯化方法及含有AT-III的制剂。

具体而言，通过从含AT-III的水溶液中生产AT-III的方法已达到了本发明的这些目的及其他目的，所述方法至少包括下述步骤(a)和(b)中的一步：

(a)在稳定剂存在下加热含AT-III的水溶液，这样加热后仍保持加热前抗凝血酶III活性的85％或更高，并且加热后抗凝血酶III单体的比率仍保持在95％或更高；和

(b)使用金属螯合树脂处理含AT-III的水溶液，并回收纯化的AT-III。

此外，通过一种药物组合物已达到了本发明的这些目的和其他目的，所述的药物组合物含有作为活性组分的按照上述方法制备的AT-III或其药物上可接受的盐，以及可选择的药物上可接受的载体。

附图简述

图1是表示来自结合铜离子的螯合树脂的AT-III的洗脱型式的曲线图。

图2是表示盐浓度对来自结合铜离子的螯合树脂的AT-III洗脱型式的影响的曲线图。

图3是表示用结合铜离子的螯合树脂纯化AT-III前后的HPLC-GPC的谱图。

图4是表示以Ouchterlony法进行的来自结合铜离子的螯合树脂的纯化AT-III前后的杂质分析结果的图形。