[发明专利]检测抗P53抗体的测定方法

说明书

本专利申请要求获得于1996年10月7日提交的美国临时专利申请号60/028,533，根据联邦法规标题35，&119(e)所包含的利益。

发明领域

本发明涉及一种检测能与p53蛋白，特别是人的p53蛋白，结合的抗体的方法。

背景

野生型p53基因是一种编码细胞的野生型p53蛋白的肿瘤抑制基因。内源性野生型p53蛋白在多种癌细胞内，如乳腺癌细胞和肺癌细胞内，是缺乏的(或缺如或突变)，已经发现给缺乏内源性野生型p53蛋白的癌细胞施予野生型p53基因能通过抑制其肿瘤的表型用以治疗癌症。见美国专利5,532,220。

在实行p53基因治疗中，极希望在曝露于外源p53基因之前及后监测患者的血清样品，以确定应此种曝露的免疫原性反应是否增高。这可通过利用在血清样品中筛选能够结合p53的抗体的试验来完成。而且，由于有些癌症患者对他们生成的突变p53产生抗体，很需要有一种诊断试验来测定血清样品中存在的能结合p53的抗体。

在PCT专利出版物WO94/10306中Soussi等披露了一种试验方法，用生物素化的肽以酶联免疫吸附试验(ELISA)的形式检测患者血清样品中的p53抗体。然而，仍极期望提供一种新的、改进的检测p53抗体的试验方法。需要改进的主要方面如下：首先，急需一种更适于检测低亲和力抗体的试验方法。采用ELISA方法在这方面有困难，因为ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，在此过程中低亲和力抗体会被洗掉。其次，需要一种比使用ELISA方式的麻烦程度低的方法。第三，需要显著地缩短分析时间，最好是每样品少于10分钟，以便能进行高流通量的分析。如上所述，ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，因此试验中所使用的材料不能再生用于其后样品的分析。

发明概述

本发明能满足前述的需要，提供一种测定能与p53蛋白结合的抗体的方法，包括：

A)将一种肽直接固定在生物传感器中的传感芯片的流动池上，该肽能特异性地与抗p53的抗体相结合，

B)从待测患者获得血清样品并将此血清样品稀释在适当的缓冲液中，

C)使稀释的血清样品与固定化的肽接触，以及

D)用生物传感器测定抗体与固定化肽的结合。

在本发明的方法中，优选使用多数的选择的免疫原性肽，每一种肽直接固定在各自分别的流动池上。优选地，第一种肽选自p53蛋白的氨基端区域，第2种肽选自p53蛋白的羧基端区域。更优选地，本发明使用以下4种肽中的一种或多种(或与之具有基本序列同一性的肽)：

a)包含序列1(C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENVLSPL-酰胺)的一种肽，或与之具有基本序列同一性的一种肽；

b)包含序列2(C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65：H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；

c)包含序列3(C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370：H-EALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；以及

d)包含序列4(C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390：H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽，

(以上列举序列采用标准的单字母氨基酸符号；见，如，Lehninger，Principles of Biochemistry，Worth Publishers，Inc第6版，1998，p.96)。

附图简述

图1以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常人血清中抗体的相对灵敏度。

图2以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常猪血清中抗体的相对灵敏度。

图3A及3B以图形描述正常人血清样品中抗体(对上述4种肽)的结合。图中缩写：NHS＝混合的正常人血清。POS＝羊多克隆抗体以1∶200稀释于混合正常人血清中。对于肽C11-35，均值为41.1，标准差(SD)为29.8；对于肽C40-65，均值为30.6，标准差为27.0；对于肽C346-370，均值为38.9；标准差为30.9；对于肽C371-390，均值为38.0，标准差为18.7。