[发明专利]来自芳族新陈代谢/I的物质的微生物制备

说明书

本发明涉及微生物制备物质的方法，所述物质特别是按照权利要求1-23、36和37的芳族氨基酸，涉及按照权利要求24-29的基因结构，和涉及按照权利要求30-35的转化细胞。

由于例如对氨基酸的需求持续增加，故微生物制备诸如精细化学药品的物质，特别是芳族氨基酸，有巨大的经济利益。因此，例如用L-苯丙氨酸制备药物，具体地说，也用于制备增甜剂天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作为药物和作为动物饲料的添加剂；对于L-酪氨酸，也同样有作为药物的需要，并也有作为制药工业中的原料的需要。除了从天然材料中分离，生物技术制备也是在经济许可的情况下获得希望的光学活性形式的氨基酸的很重要的方法。或者使用酶，或者使用微生物实现生物技术制备。后一种微生物制备享有以下优点：即可以使用简单和价廉的原料。虽然以各种各样的方式控制在细胞中生物合成氨基酸，但是，人们已经进行大量尝试，以增加产物生成。因此，例如为了切断生物合成的调节，使用氨基酸类似物。例如，根据对苯丙氨酸类似物(GB-2,053,906)的抗性通过选择获得允许L-苯丙氨酸生产增加的大肠杆菌(E.coli)的突变体。相似的策略也产生棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢杆菌属(Bacillus)(EP-0,138,526)的过量生产菌株。而且，已知使用重组DNA技术构建的微生物，在所述微生物中同样消除了生物合成的调节，具有克隆并表达的编码不再受反馈抑制的关键酶的基因。作为原型，EP-0,077,196描述了一种生产芳族氨基酸的方法，其中在大肠杆菌中过量表达不再受反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一种大肠杆菌菌株，其中为了生产L-苯丙氨酸，另外过量表达分支酸变位酶/预苯酚盐脱水酶。

上述策略共有的特征是用于提高产量的干涉只限于对芳族氨基酸特有的生物合成途径。然而，为了更进一步增加产量，必需努力提高生产芳族氨基酸所需的初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(Ery4P)的供给。

PEP是糖酵解产物丙酮酸的活化前体；Ery4P是戊糖磷酸途径的中间体。

已进行不同的尝试以使初级代谢物Ery4P的供给获得明确的增加。在大肠杆菌中通过关闭磷酸葡糖异构酶，使通过戊糖磷酸途径的碳流增加；这导致色氨酸生成(Mascarenhas D.等，Appl.Environ.微生物57(1991)2995-99)。US-A-5,168,056公开了利用重组DNA技术使转酮酶过量表达，这使获得Ery4P的供给增加成为可能，从而增加了作为产物的L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的生成。Draths K.M.等(J.Am.Chem.Soc.114(1992)3956-62)和Flores N.等(Nat.Biotechnol.14(1996)620-3)都证实了相同的结果。然而，如Feldmann指出，在没有转醛酶活性的活动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)菌株中仅仅增加转酮酶活性，导致在细胞中戊糖磷酸途径代谢物富集，并因此对细胞生长有负面影响(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。该生理效应可能是由于细胞内景天庚酮糖-7-磷酸浓度过量造成的。本发明人也发现在大肠杆菌tal⁺菌株中由于转酮酶过量表达造成的相应的生物质生长抑制。

所以本发明的目的是使得生产物质、特别是生产芳族氨基酸的的可选方法可利用，该方法的区别在于，增加细胞内这些物质合成的代谢物中间体的供给，而没有由于只增加转酮酶的活性造成的上述方法缺点。

令人惊讶的是，按照本发明，通过利用微生物制备物质的方法达到了该目的，在所述方法中，由于在该微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖性糖吸收系统活性存在、降低或消失，增加生产这些物质的微生物中的转醛酶活性。