[发明专利]用重组生物体生产甘油的方法

说明书

发明领域

本发明涉及分子生物学领域和采用重组生物体生产所需要的化合物。更具体地讲，本发明描述了分别表达或同时表达甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)的克隆基因，以提高甘油的生产。

背景

甘油是一种工业上大量需要的化合物，用于化妆品、液体皂、食品、药物、润滑剂、防冻液以及无数其它用途。甘油酯在脂肪和油脂工业中是重要的。

不是所有生物体都具有合成甘油的天然能力。然而，已知一些细菌、藻类和酵母的物种能够产生甘油。细菌地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis)和蕃茄乳杆菌(Lactobacillus lycpersica)合成甘油。发现耐盐藻杜氏藻属(Dunaliella)种和Asteromonas gracilis产生甘油以保护性抗外界高盐浓度(Ben-Amotz等，(1982)Experientia 38：49-52)。同样，各种耐渗透酵母合成甘油作为保护性措施。大多数酵母属(Saccharomyces)菌株在乙醇发酵期间产生一些甘油，并且应用渗透胁迫可以生理性增强合成甘油(Albertyn等，(1994)Mol.Cell.Biol.14，4135-4144)。本世纪初，用加入诸如亚硫酸盐或碱的导向剂(steeringreagent)的酵母属培养物，工业上生产甘油。所述导向剂通过形成无活性复合物阻断或抑制乙醛转化为乙醇；因此，可利用过量的还原性相当物(NADH)或“导向”二羟丙酮磷酸还原，以产生甘油。该方法受限于亚硫酸盐引起的酵母生长的部分抑制。该限制可以通过采用碱得到部分克服，所述碱通过不同的机理形成过量NADH相当物。在该实践中，所述碱启动Cannizarro歧化反应以由两个当量的乙醛产生乙醇和乙酸。

已经从糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)克隆并测序了编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(DAR1，GPD1)(Wang等，(1994)，J.Bact.176：7091-7095)。将DAR1基因克隆入穿梭载体并用来转化大肠杆菌，该基因在大肠杆菌中的表达产生活性酶。Wang等(同上)认为，DAR1受细胞渗透环境的调节，但是并未提示该基因在重组生物体可以如何用来提高甘油产量。

已经分离了其它甘油-3-磷酸脱氢酶。例如已经从酿酒酵母(S.cerevisiae)克隆并测序分析了sn-甘油-3-磷酸脱氢酶(Larason等，(1993)Mol.Microbiol.，10：1101，(1993))。Albertyn等((1994)Mol.Cell.Biol.，14：4135)指出，从酿酒酵母克隆编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GPD1。如同Wang等一样，Albertyn等和Larason等均认识到该基因是渗透敏感性调节的，但是并未提示该基因可以如何用于重组生物体生产甘油。

正如G3DPH一样，已经从酿酒酵母分离甘油-3-磷酸酶，并鉴定该蛋白由GPP1和GPP2基因编码(Norbeck等，(1996)J.Biol.Chem.，271：13875)。像G3DPH编码基因一样，似乎GPP2是渗透诱导的。

没有已知的技术指出由一起表达或分别表达G3PDH/G3P磷酸酶的重组生物体生产甘油。也没有已知的技术指出由具有这两种酶活性的任何野生型生物体生产甘油，所述酶活性不需要对所述细胞施与某种胁迫(盐或渗压剂(osmolyte))。Eustace((1987)，Can.J.Microbiol.，33：112-117))指出用重组DNA技术不能实现甘油生产。这些研究者通过选择性育种技术创造了杂交酵母菌株，该酵母菌株产生甘油的水平高于亲代株；然而，G3PDH活性保持不变或略微降低。

工业上需要能够在生理条件下生产甘油的微生物，尤其是当甘油本身将作为更复杂分解代谢或生物合成途径组成部分的体内底物时，所述途径可能受到渗透胁迫或加入的导向剂的干扰。

所以，上述待解决的问题是如何通过加入或增强一些酶活性引导碳流向产生甘油，特别是分别催化二羟丙酮磷酸转化为甘油-3-磷酸、然后转化为甘油的G3PDH和G3P磷酸酶。先前已经描述了重组生物体的该过程，并且该过程需要分离编码这两种酶的基因及其随后的表达。遇到令人惊奇而未曾预料到的难题是G3P磷酸酶对宿主的毒性，该毒性要求小心控制G3P磷酸酶表达水平以避免生长抑制。

发明概述

本发明提供由重组生物体生产甘油的方法，包括：(i)用包含以下一个或两个基因的表达盒转化合适宿主细胞，所述基因为：