[发明专利]化学修饰的酶

说明书

发明背景

通过定点诱变来修饰酶的特性被限制在天然氨基酸的置换，但是最近已得到克服此限制的分子生物学策略[Cornish，V.W.等(1995)Angew.chem.，Int.Ed.Engl.34：621]。但是后一种方法一般不容易在大多数实验中应用。相反，酶的化学修饰提供了酶结构简单灵活修饰的广泛潜力，由此开辟了酶特异性可控制的调节的广泛可能性。

以往开发现了通过化学修饰来改变酶特性，1966年由Bender(Polger，L.等，1966，美国化学学会杂志，88：3153)和Koshland(Neet，K.E.等，1996，美国国家科学院院报，56：1606)组首次报道，他们通过将枯草杆菌蛋白酶BPN’的活性位点丝氨酸残基化学转化为光胱氨酸(CH2OH→CH2SH)创造出硫代枯草杆菌蛋白酶。化学合成人工酶的兴趣，包括一些具有合成潜力的，由Wu，Z.-P.等(1989)美国化学学会杂志，111：4514；Bell，I.M.等(1993)生物化学，32：3754和Peterson，E.B.等(1995)生物化学，34：6616，并且最近由Suckling，C.J.等(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.，3：531重申。

酶是目前广泛接受的有机合成中的有用催化剂。然而不可能希望天然的野生型酶符合所有合成化学目的的结构，也不可能总是能将它们立体特异地转化为合成所需的目的对映体纯的物质。目前已经意识到这种酶合成应用能力的潜在限制，已经得到一些方法用于以可控制的方式使用蛋白工程的定点和随机诱变技术改变它们的特异性。然而通过蛋白工程修饰酶的特征只限于天然氨基酸置换，并且设计克服此限制的分子生物学方法不能容易地用于常规应用或大量合成。通过酶的化学修饰得到新特异性或活性在很多年来直至今天引起了化学家的兴趣。本发明人采用定点诱变-化学修饰联合的策略，因此它提供基本上无限制的在任何氨基酸位置产生新结构环境的可能性。

美国专利5,208,158描述了化学修饰的去垢酶，其中一个或多个甲硫氨酸已突变成半胱氨酸。随后半胱氨酸得到修饰以赋予酶针对氧化剂的更高稳定性。所述的化学修饰是用C_1-6烷基置换硫醇氢。

尽管美国专利5,208,158已描述了酶氧化稳定性的改变，但仍然需要发展一种或多种具有改变的特性如活性、亲核特异性、底物特异性、立体选择性、热稳定性、pH活性模式和表面结合特性的酶以用于例如去污剂或有机合成。

发明概述

现存在一种需要，即得到具有改变特性的酶，如蛋白酶。因此，本发明提供有一个或多个氨基酸被半胱氨酸残基置换的修饰酶，半胱氨酸残基通过用提供硫醇侧链的选自以下基团的取代基置换硫醇氢来修饰：

a)-SR¹R²，其中R¹是烷基，而R²是带电或极性组分；

b)-SR³，其中R³是取代的或非取代的苯基；

c)-SR⁴，其中R⁴是取代的或非取代的环己基；和

d)-SR⁵，其中R⁵是C_10-C15烷基。

在优选的实施方案中，上述硫醇侧链基团-SR³和-SR⁴进一步包含烷基R，将其置于R³或R⁴之前形成-SRR³或SRR⁴。R优选地是C_1-10烷基。

有关硫醇侧链基团-SR¹R²，R²可以是带正电或带负电的。优选地，R²是SO₃^-、COO^-或NH₃⁺。另外，R¹优选地是C_1-10烷基。