[发明专利]溶血磷脂酰胆碱的制造方法

说明书

本发明所属技术领域

这项发明涉及磷脂水解领域。具体地说，本发明涉及利用磷脂酶A₂促进磷脂酰胆碱的水解来生产溶血磷脂酰胆碱的改进方法。这项发明还涉及制造包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基质的方法。

本发明的技术背景

早在二十世纪初人们就已经知道磷脂酰胆碱可以借助酶催水解转化成溶血磷脂酰胆碱。借助蛇毒提取物使卵磷脂(磷脂酰胆碱)降解的早期研究结果已经证明蛇毒的溶血作用发生在细胞膜的卵磷脂部分。1935年，Hughes用实验证明卵磷脂转化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)的单分子膜水解与诸如pH值、温度和卵磷脂分子的表面浓度等因素有关。在单分子层中卵磷脂分子填充物大大降低了水解速度。Hanahan证明在鸡蛋卵磷脂与磷脂酶A₂之间的醚溶性络合物导致释放不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。采用95％的乙醇、氯仿或石油醚作溶剂时，不能察觉磷脂酶A₂对磷脂酰胆碱的水解作用。在1963年的报告中，Dawson完成的实验也发现了磷脂酶A₂将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸分子。Dawson曾确定酶的活性与钙离子存在与否有关，并且添加醚或丁醇将激发磷脂酶的活性。授权给Unilever Ltd.的英国专利第1,215,868号介绍了进一步方案改进，即在有脂肪(油)存在的条件下进行有磷脂酶A₂参与的磷脂的水解反应。

现有技术中揭示的磷脂酰胆碱水解方法由于存在某些缺点受到损害，其中包括水解不完全和在水解反应中产生不需要的副产物。现有方法的缺点是严重的，因为存在未反应的原始物质或不需要的副产物表示在反应的终产物中污染物的含量是不可接受的。为了获得需要的产品(即溶血磷脂酰胆碱)必须从反应产物中除掉这些不需要的成分，因此必须增补纯化步骤。

采用上述的现有方法，溶血磷脂酰胆碱的最大得率近似为磷脂酰胆碱原始物质的70％。Dawson的工作表明为了在磷脂酰胆碱水解中激发磷脂酶A₂的活性，使最大得率达到大约60至70％，需要添加醚。采用包含8vol.％(体积百分比，下同)二乙基醚的水缓冲液作为反应介质将获得溶血磷脂酰胆碱的最大得率，采用这种反应介质看到的是两相体系。Dawson还发现为了提高溶血磷脂酰胆碱的得率可以在反应介质中用6vol.％的丁醇代替二乙基醚，而乙醇和甲基异丁基己烷对增强磷脂酰胆碱的水解是无效的。Dawson的结论是醚(或丁醇)对磷脂酰胆碱水解的促进作用可能是由于密集地填充在脂界面的定向的磷脂酰胆碱分子的表面稀释作用和从界面除去抑制性的脂肪酸的羰基的结果。添加脂肪酸抑制磷脂酰胆碱的酶解，这个证据支持Dawson的结论。添加脂肪酸使反应受到抑制的原因它抑制从界面除去脂肪酸，或使钙离子与脂肪酸形成螯合物，即除去了维持磷脂酶A₂活性所需的钙离子(Ca⁺²)。Dawson认为除去钙离子是更可信的解释，因为进一步添加醚将形成两相并增加脂肪酸的溶解性，但不促进磷脂酰胆碱的水解；反之钙的浓度增加9倍将部分地减缓抑制作用。这还表明，眼镜蛇毒经纯化得到的酶(磷脂酶A₂)在水解中的活性取决于钙离子的存在。在水解反应中磷脂酶A₂对钙离子的需求以及钙离子与磷脂酰胆碱水解释放的脂肪酸的联系在技术上是已知的(Novo Nordisk)。

本发明人以前发明过多种方法，这些方法适合制备脂类混合颗粒，这些颗粒在传送药物和提供易于吸收的卡路里方面是有用的(参阅美国专利第4,874,795号和第5,314,921号)。这些方法涉及使溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸按指定的摩尔比混合。尽管这些早期的方法容易完成，但是它们都采用价格昂贵的经离析获得的高纯度的溶血磷脂酰胆碱，因此增加了脂类混合颗粒终产品的成本。

由于现有技术有上述的缺点，所以需要提出更有效地将磷脂酰胆碱转化成溶血磷脂酰胆碱的方法。该方法将更有效地利用磷脂酰胆碱，并且使反应终产物中不需要的副产物(如甘油磷酰胆碱)和污染物(如未水解的磷脂酰胆碱)更少。采用新方法将获得纯度更高的终产物，从而由于对终产物的纯化要求降低导致大幅度地降低成本和节约工时。此外，还需要简化的方法，该方法将适合生产包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类混合颗粒。用磷脂酰胆碱作原始物质将减少使用纯化的溶血磷脂酰胆碱的需求，因此将降低制造脂类混合颗粒终产品的总成本。

本发明概述