[发明专利]rDSPAαI的产生方法

说明书

发明所属技术领域

本发明涉及分离和纯化重组圆形叶口蝠(Desmondus rotundus)唾液纤溶酶原活化物(rDSPAα1)的方法、通过这种方法纯化的rDSPAα1、含有如此纯化的rDSPAα1的药物组合物以及使用如此纯化的rDSPAα1进行治疗的方法。

发明背景

由于在血管中形成血块，从而导致血栓形成。人们区别了静脉血栓形成(包括肺部栓塞)和动脉血栓形成(包括急性心肌梗塞)。肺部栓塞和心脏梗塞是威胁生命的主要疾病，需要马上进行医学治疗。

对于这种动脉和静脉血栓形成的普通治疗形式是使用纤溶酶原活化物进行酶促溶栓(Collen等，医学年度综述，39:405-423,(1988))。这些物质称为溶栓剂，它们能把纤溶酶原(血液的纤溶系统的失活酶原)转化成为活性蛋白酶、纤溶酶。接下来，纤溶酶溶解实质上是血块组分的纤维物质血纤蛋白，这就打通了阻塞的血管并恢复了血液流动。然而，因为纤溶酶相对来说是非特异性的蛋白酶，它可以通过蛋白酶解作用破坏血液中不可缺少的用于无伤止血的组分(例如血纤蛋白原)，因此增加了出血的危险性。

第一种酶促溶栓剂、链激酶和尿激酶是复合物，就一旦被注射到血液循环中，其能在全身把纤溶酶原转化成为纤溶酶，从而引起全身性的蛋白酶解。因此，使用这种组合物的溶栓疗法会出现与出血相关的复杂情况。已经研究出了较新的溶栓疗法，它以使用通常称为t-PA的组织类型的纤溶酶原活化物为基础，但是这种疗法也存在一些弊端，这包括严重的复杂性伤流、比较频繁的再阻塞、不能达到均一有效的治疗效果以及可能被易感性的纤溶酶原活化物抑制剂(例如1型纤溶酶原活化物抑制剂(PAⅠ-1)(Loskutoff，血栓症和止血法的相同之处，Vol.14,No.1(1988))灭活等。

前不久，已经从吸血蝙蝠(圆形叶口蝠)唾液和唾液腺(欧洲公开专利申请O383417(Baldus等)；欧洲公开专利申请O352119(Duong等))中纯化得到了纤溶酶原活化物蛋白质。这些纤溶酶原活化物(称为DSPA)是丝氨酸蛋白酶，它能催化纤溶酶原转变成为纤溶酶，但它们对结合血纤蛋白的纤溶酶原表现出很高的选择性，因此当其用于溶栓治疗时，可能减少出血的严重程度和频率。而且DSPA也不易被血浆抑制剂(例如PAⅠ-1)灭活，因此可能降低再阻塞的频率。

在蝙蝠唾液中可以发现两种高分子量形式的DSPA(命名为α1和α2)，二者都由几个区组成(包括蛋白酶区)，并且二者在血纤蛋白的存在下都能紧密地结合到纤溶酶原上。通过重组技术，在哺乳动物细胞培养中已产生各种形式的DSPA(Karitzschmer等，基因，105:229-237(1991)；欧洲公开专利申请0352119(Duong等))，并且已经有人描述了小规模纯化重组产生的DSPA(rDSPA)的方法(Witt等，血液(1992),79:1213-1217)。然而，还没有人公开过商业规模的和纯度适合用于药物制剂的rDSPA的分离和纯化方法。

本申请涉及以商业规模分离和纯化重组DSPAα1(rDSPAα1)的方法。所描述的本发明产生了纯度和稳定性足以适于市售和临床使用的rDSPAα1。

发明概述

本发明提供了以商业规模分离和纯化rDSPAα1，并产生适合于临床使用的产品的方法。

因此，本发明的一方面涉及从生物培养基中纯化rDSPAα1的方法，所说的方法包括下列步骤：

(a)在导致rDSPAα1和阳离子交换树脂选择性结合的装载条件下将培养基加入到阳离子交换树脂上；

(b)可以洗涤也可以不洗涤阳离子交换树脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白杂质；

(c)从阳离子交换树脂选择性地洗脱结合的rDSPAα1；

(d)在导致rDSPAα1和疏水相互作用树脂选择性地结合的装载条件下将步骤(c)中的含有rDSPAα1的洗脱液加入到疏水作用树脂上；

(e)可以洗涤也可以不洗涤疏水作用树脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白杂质；

(f)从疏水作用树脂选择性地洗脱结合的rDSPAα1；

(g)在导致rDSPAα1和亲和层析树脂选择性地结合的装载条件下将步骤(f)中的含有rDSPAα1的洗脱液加入到亲和层析树脂上；

(h)可以洗涤也可以不洗涤亲和层析树脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白杂质；

(ⅰ)从亲和层析树脂选择性地洗脱结合的rDSPAα1，以产生水溶液形式的纯化的rDSPAα1。

本发明的另一方面是通过本申请的方法分离和纯化的rDSPAα1蛋白。