[发明专利]表层蛋白的重组表达

说明书

本发明涉及在革兰氏阴性宿主细胞内重组生产表层(SurfaceLayers)蛋白和经修饰的表层蛋白的方法。

在许多真杆菌(eubacteria)及大部分的古细菌(archaebacteria)中，晶状细菌细胞表层(S-layers)形成细胞壁组分的最外层(Sleytr等，1988年，晶状细菌细胞表面层，“Springer Verlag Berlin”；Messner和Sleytr，高等微生物生理学(Adv.Microb.Physiol.)，第33卷，1992年，213-275页)。大部分目前已知的表层蛋白(S-layer protein)是由一表观分子量为40,000-220,000的同种蛋白质或糖蛋白所组成。表层组分进行自我装配，大部分晶格具有斜形(p2)、四方形(p4)或六方形(p6)对称性。细菌表层的功能仍未完全了解，但由于它们位于细胞表面，这种多孔晶状表层可能主要是用作保护性被膜、分子筛，或促进细胞粘着与表面识别。

多种微生物表层基因的遗传学数据与序列信息都已经很清楚。有关综述可参见Peyret等在“分子微生物学”(Mol.Microbiol.)第9卷(1993年)第97-109页，其中给出了这些数据的详细出处。kuen等人(基因(Gene)，第145卷(1994年)，115-120页)叙述了编码嗜热脂肪芽孢杆菌PV72表层蛋白的SbsA基因的序列及此基因的克隆方法。嗜热脂肪芽孢杆菌PV72为革兰氏阳性细菌，其表面包裹一层六角形排列的表层。表层的主要组分为一种128KD的蛋白质，这种蛋白质在细胞内非常丰富，大约占总蛋白组分的15％。已经分离鉴定了多个嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，这些菌株的表层晶格类型、表层组分的分子量和糖基化形式各不相同(Messner和Sleytr(1992年)，出处同前)。

德国专利申请号P44 25 527.6公开了嗜热脂肪芽孢杆菌表层基因的信号肽编码区序列以及由此推断出的氨基酸序列。信号肽与成熟蛋白之间的切割位点位于氨基酸序列中第30、31位氨基酸之间。编码信号肽的核酸可有效地连接至一种编码蛋白质的核酸中，以用于蛋白质的重组生产。这种生产方法中使用了已发生转化的宿主细胞。在能促使该核酸表达、生产和分泌该核酸所编码多肽的条件下培养该宿主细胞，再从培养基中分离所产生的多肽。原核生物特别是杆菌属的革兰氏阳性生物是优选的宿主细胞。

令人惊奇的是，已经发现，不仅可以在革兰氏阳性原核宿主细胞内，还可以在革兰氏阴性原核宿主细胞内重组生产表层蛋白。在后一种情形下，表层蛋白在宿主细胞内部不是以有序的包涵体形式形成的，而是出乎意料地以有序的单分子层形式形成的。

因此，本发明的一个主题是关于重组生产表层蛋白的一种方法，这种方法的特征在于：(a)提供一种转化有编码表层蛋白的核酸的革兰氏阴性原核宿主细胞，这些核酸选自(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸的核酸，其中可选择性地不含有信号肽编码区，(ⅱ)含有在遗传密码简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸；(b)在能促使该核酸表达、生产由它所编码的多肽的条件下培养宿主细胞；以及(c)从宿主细胞内分离由上述所产生的多肽。

本发明内所用术语“严谨杂交”(stringent hybridization)是指在低盐含水缓冲液(如0.2×SSC)中于55℃、优选为60℃条件下洗膜后仍能发生的杂交(参见Sambrook等(1989)，分子克隆实验室指南(Molecular Cloning.A Laboratory Manual))。

本发明的方法是在革兰氏阴性原核宿主细胞内进行的。通过此方法，出人意料地在细胞内部获得了有序表层蛋白结构。肠杆菌，尤其是大肠杆菌，可作为优选的宿主细胞。特别优选的有大肠杆菌pop2125菌株。此菌株于1996年1月31日保藏于德国德意志微生物保藏中心(“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”,Mascheroder Weg 1b,D 38124Braunschweig)，保藏号为DSM 10509。