[发明专利]从含蛋白质溶液中纯化蛋白质的方法

说明书

发明所属技术领域

本发明是一种简单、廉价并十分有效的结晶存在于含蛋白质溶液(如发酵肉汤)中的蛋白质(特别是酶)的方法。

发明背景

工业用酶通常以液体或者无定形固体形式提供。它们之所以以无定形固体而不是以结晶固体供给，主要是因为一般都认为已知的结晶酶的方法太昂贵而不能应用于工业领域。

有关酶结晶有大量文献。由于结晶酶的技术具有很强的经验性，因而很难对特定结晶过程的结果一概而论。

现在大多数已知的蛋白质结晶方法的特有的要求是：纯净的、浓缩的原始溶液；长的结晶时间；大量的化学药品，例如盐(参见，例如，生物技术和生物工程48(1995)pp.316-323)。

已描述一种工业酶的结晶过程，其中使用了一种水溶性聚合物(如聚乙二醇)(参见WO 95/01989)。

发明概述

本发明的目的是提供一种有效、廉价的方法，通过该方法可从含蛋白质溶液中获得晶态蛋白质，特别是晶态酶，而且该方法不需要加入大量的化学药品(如盐)。本发明的方法的一个重要且十分有价值的特征是：它能够从不纯的含蛋白质溶液(即除了含有所研究的蛋白质之外，还含有不同的其它物质的溶液)中分离出高纯度的晶态蛋白质，特别是晶态酶。不纯的溶液尤指含有其它蛋白质的溶液，如来源于发酵内汤的溶液。本发明使短结晶时间内获得高产率成为可能，而且该方法简单、廉价、对环境无害、适合工业需求。

如前所说，本发明提供了一种以晶态形式从含蛋白质溶液(例如包含一种以上的蛋白质溶液，如来源于发酵肉汤的溶液)纯化、分离蛋白质的方法，该方法包括：

(a)利用结晶有效量的与水混溶的有机溶剂处理含蛋白质溶液；然后

(b)以晶态形式分离所研究的蛋白质。

应该了解本发明中特别相关的含蛋白质溶液是含水溶液(即，一般来说，其中水构成基本上所有或至少大部分溶剂，兴趣蛋白质溶解于该溶剂中的溶液)。

发明详述

本发明特别提供了一种结晶存在于发酵肉汤中的蛋白质(或多肽)的方法。就此而言，术语＂发酵＂不仅指由微生物(如细菌或真菌)引起的分解或转化过程，而且指由于动植物来源的细胞的作用引起的相应过程。

发酵肉汤除了包含兴趣蛋白质或多肽外，通常还包含如底物化合物如碳水化合物、盐、细胞和其它代谢物(如核酸，特定的兴趣蛋白质或多肽之外的蛋白质或多肽)之类的许多其它物质。

当将本发明的方法运用于发酵肉汤时，最好首先对内汤进行一次或多次固/液分离技术处理，例如絮凝、离心、过滤或微量过滤，或者是它们之间的任意组合。

本发明的方法显得对相对不纯的溶液作用效果非常好，在使用本发明的方法之前，通常不再需要通过层析方法(例如，从溶液中分离出无关蛋白质)纯化发酵肉汤(或含蛋白质溶液，通过使用固/液分离技术处理发酵肉汤获得)。

本发明的另一方面，在用有机溶剂处理之前，浓缩含蛋白质溶液。浓缩过程适合通过一个或多个已知的步骤来完成，例如超滤(逆渗透)或蒸发。

本发明的又一方面，含蛋白质溶液要经过去除低分子量物质(例如盐)的步骤。这样的处理包括渗滤和透析。

虽然含蛋白质溶液的浓缩对实施本发明的方法来说不是十分重要的，但它经常是出于产量和易于操作观点的考虑。一般地说，依据本发明，兴趣蛋白质在有机溶剂处理过的含蛋白质溶液中的浓度应在0.1-25％(重量)范围内(％w/w；基于含蛋白质溶液的重量)，最好是在0.5-15％w/w的范围内，特别是在5-15％w/w范围内。

如上文所说明的，本发明中优选的蛋白质是酶，例如：

水解酶(EC 3)[包括蛋白酶(肽酶，EC 3.4)；羧基酯水解酶(EC3.1.1)，如脂肪酶(例如三酰甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)；糖苷酶(EC 3.2)，如淀粉酶(例如α-淀粉酶，EC 3.2.1.1,β-淀粉酶，EC 3.2.1.2及葡糖淀粉酶，EC 3.2.1.3)，纤维素酶(例如内-1,4-β-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)和木聚糖酶(例如内-1,3-β-木糖苷酶，EC 3.2.1.32)]；

氧化还原酶(EC 1)[包括酚氧化酶如漆酶(EC 3.10.3.2)和按EC 1.10.3分类的其它与漆酶有关的酶；过氧化物酶(EC 1.11)，如按EC 1.11.1.7分类的那些酶]；以及

异构酶(EC 5)[包括木糖异构酶(EC 5.3.1.5)]。