[发明专利]用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母

权利要求书

1．将木糖发酵为乙醇的酵母，包括：在酵母多个重复核糖体DNA位点的每个位点具有整合基因的酵母，所述的基因编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶。

2．权利要求1的酵母，也将葡萄糖发酵为乙醇。

3．权利要求2的酵母，为糖酵母属。

4．权利要求3的酵母，其中所述的位点为非转录DNA位点。

5．权利要求1的酵母，其中所述的基因融合到不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。

6．权利要求5的酵母，其中的启动子无需木糖诱导。

7．权利要求3的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。

8．权利要求4的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇，这些启动子也无需木糖用于诱导。

9．权利要求6的酵母，其中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因来自将木糖发酵为乙醇的天然酵母。

10．权利要求9的酵母，其中的天然酵母为休哈塔假丝酵母、具柄毕赤酵母或Pachysolen tannophilus。

11．权利要求9的酵母，其中的木酮糖激酶基因来自酵母或细菌。

12．权利要求11的酵母，其中的木酮糖激酶基因来自休哈塔假丝酵母、具柄毕赤酵母、Pachysolen tannophilus、啤酒糖酵母、粟酒裂殖糖酵母或大肠杆菌。

13．具有在酵母的至少约10个核糖体DNA位点整合的所述基因的权利要求1的酵母。

14．用于整合多拷贝外源DNA至细胞重复染色体DNA中的方法，包括：

(a)以具有包括第一种筛选标记外源DNA的复制和整合性质粒转化细胞；和

(b)反复复制步骤(a)的细胞以制备许多代的子代细胞同时筛选包括此筛选标记的细胞，从而促进该复制和整合性质粒在随后子代细胞中的保留并且制备具有多拷贝整合外源DNA的子代细胞。

15．权利要求14的方法，其中的质粒DNA也包括用于筛选包括此质粒细胞的第二种筛选标记。

16．权利要求14的方法，其中的细胞为酵母或真核细胞，并且其中的方法进一步包括反复复制步骤(b)的子代细胞的步骤从而在对于包括此筛选标记的细胞无选择的条件下制备许多代的子代细胞，从而促进该质粒在随后子代细胞中的丢失并且回收每个含多拷贝整合到其染色体DNA中外源DNA的酵母细胞。

17．权利要求16的方法，其中的细胞为酵母细胞并且外源DNA包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，它们同时用作第一种筛选标记。

18．权利要求14的方法，其包括：

(ⅰ)从具有包括筛选标记的外源DNA的复制性质粒转化酵母细胞，该外源DNA的每个侧翼端为与宿主DNA重复序列同源的DNA序列；

(ⅱ)反复复制步骤(ⅰ)的转化酵母细胞以制备许多代的子代细胞同时筛选包括该筛选标记的细胞，从而促进该复制性质粒在随后子代细胞中保留并得到每个含有多拷贝整合外源DNA的子代细胞；和

(ⅲ)复制步骤(ⅱ)的子代细胞以在对于包括该筛选标记的细胞缺乏选择的条件下制备许多代子细胞，从而促进该质粒在随后子代细胞中的丢失并且回收每个含多拷贝整合到其染色体DNA中外源DNA的酵母细胞。

19．由权利要求18的方法制备的酵母细胞。

20．权利要求19的酵母细胞，其中的外源DNA包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，并且此酵母细胞发酵木糖至乙醇。

21．权利要求20的酵母细胞，其中所述的基因融合至无需木糖诱导并且不受葡萄糖抑制的启动子上，并且其中的酵母细胞同时发酵葡萄糖和木糖至乙醇。

22．根据权利要求21的酵母细胞，它们在非选择条件下培养至少20代时基本上维持其发酵木糖至乙醇的能力。