[发明专利]用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母

说明书

                       背景

本发明广泛涉及遗传工程微生物且特别地涉及用于稳定掺入外源DNA至细胞，包括掺入多拷贝外源DNA至宿主中重复DNA序列处的独特方法。在优选的方面，本发明涉及能够将木糖(优选其发酵木糖与葡萄糖)至乙醇的酵母。更为特别的是，本发明的优选方面涉及含有编码木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XD)和木酮糖激酶(XK)克隆基因的酵母，该酵母甚至在非选择性培养基中培养很多代后仍基本上维持将木糖发酵至乙醇的效率。

作为进一步的背景，最近研究表明乙醇为理想的汽车液体燃料。其可作净燃料(100％乙醇)直接使用或以各种浓度与汽油混合使用。使用乙醇补充或替代汽油可降低许多国家对进口外来原油的依赖并且也提供用于运输的可再生燃料。此外，已证明乙醇较常规的汽油提供更为清洁的燃料，其向环境中释放少得多的污染物。例如，已经证实在汽油中使用氧物质可减少一氧化碳，一种有害的污染物释放入空气中。目前用于增加汽油中氧气含量的几种增氧剂(oxygenates)中，乙醇具有最高的氧气含量。美国环保署(EPA)已显示混合了10％乙醇的汽油降低一氧化碳排放约25％-30％。

到现在，用于通过发酵制备工业乙醇的原料为来自蔗糖或甜菜的糖和来自玉米或其它粮食作物的淀粉。然而，这些农作物目前被认为是太昂贵而不能用作大规模制备燃料乙醇的原料。植物生物体是用于通过发酵进行乙醇燃料制备的有吸吲力的原料因为其是可再生的并且可以低价和大量而得到。使用由微生物发酵糖而制备的乙醇的概念至少起源于二十年以前。来自纤维素材料的主要可发酵的糖为葡萄糖和木糖，其中的葡萄糖和木糖的比例大约为2或3到1。当然，纤维素材料最为理想的发酵将完全将葡萄糖和木糖转变为乙醇。不幸的是，甚至现在还没有一种已知既能够有效发酵葡萄糖又能够有效发酵木糖的天然微生物。

酵母，特别是糖酵母属酵母被传统用于将基于葡萄糖的原料发酵成为乙醇，并且仍然认为它们是用于该目的最好微生物。然而，已发现这些葡萄糖发酵酵母，包括糖酵母属不能够发酵木糖并且也不能够用此戊糖来生长。

近年来，N.Ho等开发出重组酵母，特别是能够有效地将木糖发酵成乙醇的重组糖酵母属酵母(Ho和Tsao,1995)。更为特别地是，优选的重组酵母能够将纤维素生物体的2种主要糖组分，葡萄糖和木糖共发酵成乙醇(Ho和Tsao,1995)。通过以高拷贝数含有编码木糖代谢三个关键酶的三个克隆基因XR、XD和XK的质粒转化酵母而开发出这些重组酵母(图1)。图2和图3显示了2种以前制备的称为1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的重组糖酵母属酵母，它们能够将存在于相同培养基中的8％的葡萄糖和4％的木糖在2天中几乎完全共发酵成乙醇。另一方面，图4显示了母本酵母融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)仅可发酵葡萄糖至乙醇而不可发醇木糖至乙醇。通过以2个高拷贝数的显示于图1中的质粒pLNH32和pLNH33转化糖酵母属融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)而开发出1400(pLNH32)(简称LNH32)和1400(pLNH33)(简称LNH33)。到目前为止，已报导了4种这样的高拷贝数质粒，pLNH31、pLNH32、pLNH33和pLNH34(Ho和Tsao,1995)。这些质粒中的每一种可转化融合1400至重组酵母从而以相近的效率其转化葡萄糖和木糖。

其木糖代谢基因被克隆于基于2μ稳定高-拷贝-数质粒上的酵母1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和有关的重组木糖-发酵的糖酵母属酵母十分适用于批量工艺发酵(process fermentation)。然而，在连续的工艺发酵中，在富含葡萄糖的培养基中长期培养后(大于20代)，1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和类似的质粒介导的重组酵母丧失其发酵木糖的能力，如图5和图6中所示。

通常，外源DNA或基因可通过2种独立的方式克隆入酵母。一种方式是将外源DNA或基因克隆入含有可筛选遗传标记和使质粒能够在此新宿主中自主复制的有功能的酵母DNA复制起点或ARS(自主复制序列)的质粒载体中(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)，然后以含有所需克隆的DNA片段或基因的质粒转化所需的酵母宿主。得到酵母转化子能够在选择压力存在下稳定地维持该克隆的基因。然而，该克隆的基因在无选择的培养基(缺少选择压力)时长期培养后是不稳定的。