[发明专利]作为遗传物质转移系统的阳离子病毒体

说明书

发明领域

本发明涉及基因生物技术和基因治疗领域，并且涉及用于有效地向靶位置转移遗传物质的新的病毒体，即膜中包含病毒糖蛋白的正电荷脂小泡，涉及其制备方法和有用的应用。本发明阳离子病毒体特别适合体外和体内向靶细胞特异性的和非特异性的，非感染性的基因运送。

发明背景

脂质体被广泛用作药物运送的载体和用作有效期短的药物或者抗体液(生物)化学侵害的保护性掩蔽剂。包含来自病毒被膜的重组膜蛋白或其部分的脂质体通常称之为“病毒体”(Sizer等，生物化学(Biochemistry)26:5106-5113,1987)。其已经被用来非特异性运送各种药物和DNA分子(Vainstein等，酶方法(MethodsEnzymol.)101:492-512,1983)。其主要缺点在于这些病毒体与靶细胞的细胞膜融合，导致运送的物质没有控制地释放到靶细胞的细胞质中，在那里没有保护的物质容易被细胞内降解过程破坏。

WO92/13525，其全文在此引入作为参考，报道了来自流感病毒的病毒刺突蛋白所指向的，并且有细胞特异性标记例如单克隆抗体的磷脂双分子层膜制备的病毒体，根据通过受体介导的内吞作用的类病毒穿入机理，非常有效地与膜模型和动物细胞融合。在这些病毒体成功地应用于将化学物质和期望的药物运送到靶位置的同时，关于稳定掺入和转移带电荷分子，例如负电荷核酸，其仍有一些缺点。

在过去的几年里，脂质体中掺入的遗传物质的运送，特别是细胞特异性运送越来越引起关注且越来越重要，特别是关于在抗癌和基因治疗中的应用。目前有几种方法适合向细胞运送DNA或RNA：病毒介导的方法，脂质介导的方法，和其它方法，象微注射和电穿孔。目前基因转移技术的优点和缺点可以总结如下：8)病毒介导的基因转移：基因可以通过利用逆转录病毒载体而被稳定且有效地导入哺乳动物细胞。但是基因向非复制型细胞的转移的效率非常低，因为逆转录病毒只感染分裂的细胞。而且，一般所关心的安全问题和与例如癌基因可能的激活有关的逆转录病毒载体的使用有关。复制缺陷腺病毒成为大多数研究人员的基因转移载体的选择。腺病毒载体介导的基因运送包括期望的基因向缺陷腺病毒粒子的插入或者要插入的DNA和腺病毒外被之间通过运铁蛋白-聚赖氨酸桥的复合物的生成。该体内非常有效的系统的缺点是有感染或炎症的危险：尽管有使病毒对于复制是有缺陷的之E1基因缺失，但是剩余的病毒基因组仍包含数个编码病毒蛋白质的可读框(Yang等，1994；美国国家科学院学报91,4407-4411)。病毒蛋白质通过转导细胞的表达引起动物和人体内体液和细胞免疫应答，因此可以引起炎症和增生。

在HVJ(仙台病毒)介导的方法中，外来DNA与脂质体相复合。然后脂质体负载了灭活的仙台病毒(日本的血凝病毒；HVJ)。该方法已经用于体内对各种组织的基因移植。另外，业已报道了细胞通过HVJ-脂质体摄入反义寡核苷酸(Morishita等，1993；细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)17E,239)。但是一个特别的缺点是HVJ-脂质体有非特异性结合红细胞的倾向。b)脂质介导的基因转移：由阳离子脂类制备的带正电荷脂质体表现出使用安全方便，并且对于体外转移DNA和反义寡核苷酸是有效的。高负电荷核酸自发与阳离子脂质体相互作用。通过简单地混合聚核苷酸和预先生成的阳离子脂质体，已经实现了DNA-脂质体复合物的完全生成。但是，由于脂质体膜上缺少融合蛋白和细胞特异性标记，所以体内转染的效率非常低，并且培育时间长，为了达到期望的效果不得不高剂量给药。结果是，可以发生不期望的副作用，因为有证据证明大量的阳离子脂质在体内可以表现出毒副作用。