[发明专利]G－β－γ调控的磷脂酰肌醇－3'激酶

说明书

1．导言

本发明涉及新型的G-蛋白调控的磷酸肌醇3OH-激酶，该酶从造血谱系细胞中分离，其参与细胞信号传导途径，本发明还涉及这些新型的酶在疾病的治疗和诊断中的应用。

2．发明背景

磷酸肌醇3OH-激酶(PI3K)是一个酶类大家族，可以3-磷酸化至少一种胞内磷酸肌醇。(Whitman等，1988，自然(Nature)332:644-646；Ayger等，1989，细胞(Cell)57:167-175)3-磷酸化的磷酸肌醇存在于所有高等真核细胞中。越来越多的证据表示出PI3K和此酶的一个脂类产物，磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(以下简称“PtdIns(3,4,5)P₃”)，是新型的重要的细胞信号传导中第二信使系统的一部分。这一新型的基于PtdIns(3,4,5)P₃的信号系统的成分看来独立于已表征的基于肌醇磷脂的信号途径，在后者中磷酸肌醇酶C(phosphoinositidase C)(PIC)水解PtdIns(4,5)P₂释放结构独特的第二信使肌醇(1,4,5)-三磷酸(Ins(1,4,5)P₃)和二酰甘油。

所选的胞外激动剂和生长因子将刺激胞内PI3K的活性并导致快速且短暂的胞内PtdIns(3,4,5)P₃的累积。令人吃惊的是，多种不同类型的细胞表面受体的刺激，包括受体酪氨酸激酶、与src家族非受体性酪氨酸激酶结合的受体、细胞因子类生长因子及G蛋白偶联受体，都将激活PI3K家族的成员(综述见Stephens等，1993,Biochemica et Biophysica Acta,1179:27-75)。例如，酪氨酸激酶受体，其激活后导致PtdIns(3,4,5)P3的累积增加的有PDGF受体、EGF受体、FGF受体家族的成员、CSF-1受体、胰岛素受体、IGF-1受体和NGF受体。刺激PtdIns(3,4,5)P₃的累积增加的与src家族非受体性酪氨酸激酶结合的受体有Ⅱ-2受体、Ⅱ-3受体、mIgM受体、CD4受体、CD2受体和CD3/T细胞受体。另外，细胞因子Ⅱ-4受体和与G蛋白结合的凝血酶受体、ATP受体和fMLP受体，它们均刺激PI3K的活性，随后导致PtdIns(3,4,5)P₃的累积。这样看来，PtdIns(3,4,5)P₃在非常不同的信号途径中作为第二信使。

PI3K的活性和PtdIns(3,4,5)P₃的产生是产生这些多种多样的受体的信号传导的一个生理相关途径这一命题，特别是从以下两组不同的实验证据中得到了支持：一个实验是真菌代谢物抑制PI3K活性，一个是观察直接的蛋白连接。渥曼青霉素(一种真菌代谢物)通过以共价方式连接在PI3K的催化结构域而不可逆地抑制其活性。渥曼青霉素对PI3K活性的抑制消除了随后的因胞外因子产生的细胞反应。例如，通过刺激PI3K并合成PtdIns(3,4,5)P₃，嗜中性粒细胞应答趋化因子fMet-Leu-Phe(fMLP)。PtdIns(3,4,5)P₃的合成与在嗜中性粒细胞破坏入侵微生物过程中的呼吸爆发(respiratory burst)的激活相关。用渥曼青霉素处理嗜中性粒细胞避免了fMLP诱导的呼吸爆发反应(Thelen等，1994,PNAS,USA 91:4960-4964)。确实，这些渥曼青霉素实验以及其它实验证据表明，在造血谱系细胞中，特别是嗜中性粒细胞、单核细胞及其它类型白细胞中PI3K的活性参与很多与急性和慢性炎症相关的非记忆性免疫反应。

这些PI3K酶与一些活化的受体酪氨酸激酶直接相互作用，并可被共同提纯。纯化后发现，与受体酪氨酸激酶相结合的PI3K包含一些170-200kD的异源二聚体(Otsu等，1991，细胞65:91-104,Pons等，1994，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)15:4453-4465,Inukai等，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:5317-5320)，二聚体中包含一个催化亚基和一个衔接(或调控)亚基。