[发明专利]来自枯草芽孢杆菌的植酸酶,编码所述植酸酶的基因,该基因产物的生产方法及其用途

说明书

本发明涉及植酸酶，编码植酸酶的核酸以及植酸酶的生产方法和它的用途。

发明背景

亚磷是生长的必需元素。在许多食品和动物饲料中，亚磷主要是以磷酸盐的形式存在，并且同被称作植酸酶(肌醇六磷酸激酶)的分子共价结合。由于肌醇六磷酸自身没有被消化好并且磷酸盐在很大程度上是在动物的小肠内被吸收的，磷酸盐在肌醇六磷酸中螯合并且没有在动物的小肠内被吸收，而是经过消化道并且被排泄掉。这造成亚磷对土地和水系的生态负担增加。另外，由于植酸酶可同许多必需矿质元素形成螯和物，并且抑制它们在消化道内的吸收，因此，植酸酶会降低食品或饲料的营养价值。

另一个同肌醇六磷酸的低消化率相关的问题是需要向动物饲料中加入无机磷酸盐，这样会使饲料的价格增加。

肌醇六磷酸是由被称作植酸酶的酶所转化的，该酶催化肌醇六磷酸水解成为肌醇和无机磷酸盐。在麸皮和植物种子中有植酸酶并且已知可用各种微生物，包括酵母，真菌和细菌来生产植酸酶。

在已知的真菌植酸酶中，Yamada等将土曲霉植酸酶纯化到均质(农业生物化学，32(10)(1968),1275-1282)，并且显示出该植酸酶的最适pH值为4.5，在pH值为4.5时最适温度为70℃并且在30到60℃的温度范围内是热稳定的。但是，所述酶在中性pH值下，特别是在pH值为7.0时则完全失活。

另外，H.J.Ullah和D.M.Gibson分离并鉴定了无花果曲霉植酸酶(Preparative Biochemistry,17(1)(1987),63-91)，并且显示出该植酸酶具有两个最适pH值，一个是2.2，另一个是5.0-5.5，在pH值为5.0时，最适温度为58℃并且在pH为5.0时直到68℃时都是热稳定的。但是，正如土曲霉植酸酶的情况一样，无花果曲霉植酸酶在pH值为7.0时也失去活性。

已经对来自土曲霉(EP 684 313)和无花果曲霉(EP 420 358)以及黑曲霉awamori变种(Piddington等，(1993)基因，133,55-62)的编码植酸酶的DNA序列做了鉴定并进行了重组表达。

也知道象枯草芽孢杆菌(V.K.Powar和V.Jagannathan,(1982)细菌学杂志，151(3),1102-1108)和枯草芽孢杆菌(纳豆变种)(M.Shimizu,(1992)生物科学、生物技术、生物化学，56(8),1266-1269和日本专利申请6-38745)一类的细菌也可以作为植酸酶的来源。

用SDS-PAGE将Shimizu(上文)描述的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶纯化至均质，显示出的分子量在36和38kD之间。当在含有0.1M马来酸，2mM的氯化钙和1.6mM的肌醇六磷酸钠的分析溶液中于37℃下测定时，该酶的最适pH值在6.0和6.5之间，当在含有0.1M的Tris-HCl缓冲液，2mM的氯化钙和1.6mM的肌醇六磷酸的溶液中于37℃下测定时，该酶的最适pH为7.0。该植酸酶的最适温度为60℃而且当该酶在上面提到的含有Tris-HCl缓冲液的溶液中温浴15分钟时，该酶直到50℃时还是稳定的。在含有所述Tris-HCl的溶液中纯化的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶的报道比活为8.7U/mg蛋白。将一个单位的植酸酶定义为：在这样的分析条件下，每分钟释放1微摩尔的磷酯酰肌醇所需要的酶量。始终使用这一定义。

Powar等(如上文)描述了从枯草芽孢杆菌中分离出分子量为36.5kD并且具有肌醇六磷酸专一性的植酸酶制剂。这种酶制剂是用SDS-PAGE所纯化，并且发现包括两种植酸酶同功酶，当在含有0.1M的Tris-HCl缓冲液，0.5mM的氯化钙和0.34mM的肌醇六磷酸钠的检测溶液中于30℃下测定时，该酶所显示出的最适pH值在7.0和7.5之间。在60℃下，该植酸酶同功酶混合物显示出最大的活性并且直到70℃都是稳定的。所报道的在上述检测溶液中测定的纯化酶的比活为8.5到9.0U/mg蛋白。另外，据Powar等人(上文)报道，纯化的同功酶混合物具有水解蛋白的活性，这样会导致活性的丧失。

目前还不知道芽孢杆菌植酸酶的氨基酸序列和编码芽孢杆菌植酸酶的核酸序列。

在处理食品和动物饲料的过程中向食品和动物饲料中添加天然或重组的植酸酶，从而使肌醇六磷酸经酶转化为可消化的磷酸盐，已经有了关于这种想法的描述。JP-A-38745描述了用纯化的天然存在的枯草芽孢杆菌(纳豆变种)植酸酶在处理饲料和食品中的用途。另外EP420358和EP684 313中描述了曲霉植酸酶在动物饲料中的用途。