[发明专利]制备血小板生成素多肽的表达载体、细胞和方法

权利要求书

1．在真核宿主细胞中可复制的表达载体，包含以下可操作连接的元件：

(a)转录启动子；

(b)编码分泌前导肽的第一段DNA片段；

(c)编码含C-X-B的血小板生成素(TPO)多肽的第二段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或包含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数并且其中B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代；及

(d)转录终止子。

2．根据权利要求1所述的表达载体，其中所述载体可在酵母中复制。

3．根据权利要求2所述的表达载体，其中所述分泌前导肽是酿酒酵母α因子的分泌前导肽。

4．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是9。

5．根据权利要求1所述的表达载体，其中B包含Thr-Thr二肽。

6．根据权利要求1所述的表达载体，其中B不包含Arg-Arg二肽。

7．根据权利要求1所述的表达载体，其中B中至多25％的所述残基分别被其它氨基酸残基替代。

8．根据权利要求1所述的表达载体，其中B的残基1至5是Ala-Pro-Pro-Thr-Thr(SEQ ID NO:8)。

9．根据权利要求1所述的表达载体，其中B的第4个残基是Thr或Asp。

10．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是10并且B的第10个残基是Arg或Glu。

11．根据权利要求1所述的表达载体，其中y至少是14并且B的第14个残基是Val或Ala。

12．根据权利要求11所述的表达载体，其中B是Ala-Pro-Pro-Thr-Thr-Ala-Val-Pro-Ser-Arg-Thr-Ser-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Asn(SEQ ID NO:4)。

13．根据权利要求1所述的表达载体，其中B选自SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。

14．根据权利要求1所述的表达载体，其中X是肽键。

15．根据权利要求1所述的表达载体，其中X是单个氨基酸残基。

16．根据权利要求1所述的表达载体，其中C包含SEQ ID NO:2的残基1至152。

17．根据权利要求1所述的含表达载体的培养的真核细胞，其中所述细胞合成并分泌所述TPO多肽。

18．根据权利要求17所述的酵母细胞。

19．血小板生成素多肽，其特征是包含C-X-B氨基酸主链，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代。

20．生产TPO多肽的方法，包括：

培养用可在宿主细胞中复制并包含以下可操作连接元件的表达载体转染或转化的宿主细胞：

(a)转录启动子；

(b)编码分泌前导肽的第一段DNA片段；

(c)编码包含C-X-B的血小板生成素的第二段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸替代；及

(d)转录终止子；

其中宿主细胞表达连接的第一段和第二段DNA片段合成TPO多肽；并且

回收TPO多肽。

21．增加哺乳动物中血小板数目的方法，包括给所述动物施用与药学上可接受的载体结合的血小板生成素多肽，此多肽的特征在于包含C-X-B的氨基酸主链，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是含SEQID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且B中至多35％的所述残基可分别被其它氨基酸残基替代。