[发明专利]制备血小板生成素多肽的表达载体、细胞和方法

说明书

发明背景

血细胞生成是骨髓中多能干细胞发育和分化成血细胞的过程。此过程涉及多肽生长因子(细胞因子)复杂的相互作用，其中多肽生长因子通过靶细胞上的膜结合受体起作用。细胞因子作用对通常种系特异和/或阶段特异的特殊细胞因子产生应答，导致细胞增殖和分化。来自干细胞的单细胞类型如血小板的发育需要以适当顺序起作用的细胞因子的复杂协调作用。

已知的细胞因子包括白细胞介素，如IL-1,IL-2,IL-3,IL-6,IL-8等；及集落刺激因子，如G-CSF,M-CSF,GM-CSF，红细胞生成素(EPO)等。通常，白细胞介素作为免疫和炎症反应的介质。集落刺激因子刺激骨髓源细胞增殖，激活成熟的白细胞，并形成宿主对炎症、感染和免疫攻击应答的不可缺少的部分。

各种细胞因子已开发为治疗试剂。例如，刺激红细胞发育的红细胞生成素已用于治疗肾衰竭引起的贫血症。几种集落刺激因子已用于与癌症化疗结合加速恢复病人免疫系统。白细胞介素-2,α-白细胞介素和C-白细胞介素用于某些癌症的治疗。刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性物质已在血小板生成的动物体液中得到鉴定并在文献中称为“血小板生成素”(近期由Mcdonald，实验血液学16:201-205,1988和McDonald，美国儿童血液肿瘤学杂志14:8-21,1992综述)。纯化和鉴定此活性物质的工作导致与细胞Mpl受体结合并刺激巨核细胞生成和血小板生成的蛋白的克隆。见de Sauvage等，自然369:533-538,1994；Lok等，自然369:565-568,1994；Kaushansky等，自然369:568-571,1994；Wendling等，自然369:571-574,1994；Bartley等，细胞77:1117-1124,1994；和WIPO公开WO 95/21920。此Mpl受体结合细胞因子称作血小板生成素。

氨基酸序列分析表明成熟的人TPO是从SEQ ID NO:2的氨基酸残基1(Ser)延伸至氨基酸残基332(Gly)。TPO容易受蛋白水解并已以异源或降解形式得到分离(de Sauvage等，自然369:533-538,1994；Bartley等，细胞77:1117-1124,1994)。已发现25kD的小分子类型在体外有活性(Bartley等，ibid)，并有报道重组的153个氨基酸(deSauvage等，ibid)和174个氨基酸(Bartley等，ibid)的人TPO多肽在体外有活性，编码353个氨基酸(Bartley等，ibid)初始翻译产物的全长人cDNA的表达产物也在体外有活性。

本领域需要大量高效生产血小板生成素的方法；也需要在真核微生物如酵母中生产血小板生成素的方法；进一步需要有效生产低分子量形式的血小板生成素的方法，低分子量形式的血小板生成素与全长分子相比更不易受蛋白水解。本发明满足这些要求并具有其它相关的优势。

发明概述

一方面，本发明提供能在真核宿主细胞中复制的表达载体。载体包括以下可操作连接的元件：(a)转录启动子；(b)编码分泌前导肽的第1段DNA片段；(c)编码含C-X-B的血小板生成素(TPO)多肽的第2段DNA片段，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；X是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是X单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数并且B中至多35％的氨基酸残基可分别被其它氨基酸残基替代；及(d)转录终止子。在发明的一个实施方案中，表达载体可在酵母中复制。在另一个实施方案中，分泌前导肽是酿酒酵母的α因子分泌前导肽。在另一个实施方案中，B不包括Arg-Arg二肽。在其它实施方案中，B的第4位残基是Thr或Asp；y至少是10并且B的第10个残基是Arg或Glu；以及y至少是14并且B的第14个残基是Val或Ala。在另一个实施方案中，y至少是14,B的第4个残基是Thr或Asp,B的第10个残基是Arg或Glu，并且B的第14个残基是Val或ala。在其它实施方案中，X是肽键或单个氨基酸残基。

发明的另一方面提供了包含如上公开的表达载体的培养真核细胞，其中细胞合成并分泌TPO多肽。在优选实施方案中细胞是酵母细胞。

发明的第三方面，提供以含C-X-B氨基酸主链为特征的血小板生成素多肽，其中C是人血小板生成素细胞因子结构域多肽；x是肽键或含1或2个氨基酸残基的接头，限制条件是x单独或与C或B结合时不提供双碱性氨基酸对；而B是包含SEQ ID NO:3的残基1至y的多肽，其中y是从5至18的整数，并且其中B中至多35％的残基可分别被其它氨基酸残基替代。