[发明专利]利用芽孢杆菌进行纤维素结合结构域(CBD)的细胞外表达无效

专利信息
申请号: 97199193.6 申请日: 1997-10-28
公开(公告)号: CN1235635A 公开(公告)日: 1999-11-17
发明(设计)人: M·E·布兰瓦德;M·舒赖恩;P·L·乔根森 申请(专利权)人: 诺沃挪第克公司
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12N15/75;C12P21/02;C12N9/42;//;C12R1107)
代理公司: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 黄革生
地址: 丹麦*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 利用 芽孢 杆菌 进行 纤维素 结合 结构 cbd 细胞 外表
【权利要求书】:

1.一种芽孢杆菌宿主,其转化了包含编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列的载体并能表达该序列,所表达的多肽基本上由一个或多个非催化性结构域组成。

2.根据权利要求1的宿主,其中所述DNA序列是另一种来源而非芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或2的宿主,其能以单一多肽结构域形式表达该纤维素结合结构域。

4.根据权利要求1至3中任一项的宿主,其中所述纤维素结合结构域的分子量为4kD-35kD。

5.根据权利要求4的宿主,其中所述纤维素结合结构域的分子量不高于30kD,优选不高于28kD,更优选不高于25kD。

6.根据权利要求1-5中任一项的宿主,其中所述载体包含编码单一纤维素结合结构域的DNA序列。

7.根据权利要求1-5中任一项的宿主,其中所述载体包含编码二聚体或三聚体纤维素结合结构域的DNA序列。

8.根据权利要求1-5中任一项的宿主,其中所述载体包含编码连有至少一个其他非催化活性结构域的纤维素结合结构域的DNA序列。

9.根据权利要求1-8中任一项的宿主,其中所述纤维素结合结构域可得自微生物或植物,优选得自细菌或真菌。

10.根据权利要求9的宿主,其中所述细菌选自由以下各属组成的组:丁酸弧菌属、纤维单胞菌属、梭菌属、小双孢菌属、小单孢菌属、假单胞菌属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、Caldocellum、欧文氏菌属、粘球菌属、纤维弧菌属、热厌氧杆菌属和栖热袍菌属。

11.根据权利要求9的宿主,其中所述真菌选自由以下各属组成的组:蘑茹属、网柄菌属、镰孢属、腐质霉属、Neocallimastix,脉孢菌属,Limulus,青霉属,Phanerochaete和木霉属。

12.根据权利要求1-11中任一项的芽孢杆菌宿主,其为嗜中性的、嗜碱性的、嗜温性的或嗜热性的。

13.根据权利要求12的芽孢杆菌宿主,其选自由下列各种组成的组:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

14.根据权利要求1-13中任一项的宿主,其中所述载体整合至未转化宿主的基因组中。

15.根据权利要求1-14中任一项的宿主,其中所述载体以表达质粒形式存在。

16.根据权利要求1-15中任一项的宿主,其中所述载体已在基因组内发生了扩增,或者所述表达质粒为多拷贝质粒。

17.一种芽孢杆菌表达载体,其携有插入的编码纤维素结合结构域的DNA序列。

18.根据权利要求17的载体,其内表达盒包含源自芽孢杆菌的调控区。

19.根据权利要求18的载体,其中所述芽孢杆菌调控区对该宿主是内源的。

20.在芽孢杆菌宿主细胞中生产纤维素结合结构域多肽的方法,该方法包括以下步骤:

--在营养培养基中,过量生产纤维素结合结构域的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,所述宿主细胞已转化了包含可操作性地连接在一起的下述元件的表达盒:

a)转录和翻译起始调控区,

b)编码纤维素结合结构域多肽的DNA序列,

c)转录和翻译终止调控区,其中所述调控区在该宿主中是有功能的,和

d)用于选择已转化的宿主的选择性标记基因;和

--回收纤维素结合结构域多肽。

21.根据权利要求20的方法,其中生产的纤维素结合结构域多肽的分子量为4kD-35kD。

22.一种优化芽孢杆菌宿主中CBD表达的方法,该方法包括以下步骤:

a.在宿主中表达融合于报道分子的CBD,

b.通过测定报道分子的内在性质,鉴测已发酵宿主的上清中已表达CBD的浓度。

23.根据权利要求22的方法,其中所述报道分子是绿色荧光蛋白,所述内在性质为发射荧光。

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