[发明专利]利用芽孢杆菌进行纤维素结合结构域(CBD)的细胞外表达

说明书

本发明涉及一种能表达纤维素结合结构域多肽的转化芽孢杆菌宿主，一种芽孢杆菌表达载体，以及在芽孢杆菌宿主细胞内生产纤维素结合结构域的方法。

发明背景

对CBD作为一种功能性结构域的研究涉及到以单一结构域分子合成该结构域。最早的纯CBD之一是通过自动固相合成法合成的(KraulisP.等(1989))。

已示CBD能以功能性的单一结构域形式在大肠杆菌中表达，参见例如：Ong E.等(1993)，其中公布，采用大肠杆菌进行的表达在细胞外围胞质中每升培养液的CBD产量为33mg。

最近，在大肠杆菌中也成功地表达了真菌CBD二体(二聚体)，见Linder M.等(1996)。

然而，CBD在大肠杆菌内的表达并不是真正的细胞外表达，并且产量也不尽如人意，对于CBD的工业水平生产来说该产量有些太低。

US5525195,US5536655,WO 91/17244和WO 91/10732公开了具有可操作地连接了纤维素结合结构域的催化活性结构域的内切葡聚糖酶在芽孢杆菌宿主细胞内的表达。

据此，本发明的目的是提供一种以高产率生产CBD的方法，该方法优选采用涉及CBD的细胞外生产的常规发酵技术，这样使得CBD在工业上的应用更为经济可行。

发明概述

本发明人现已发现可通过在芽孢杆菌宿主中表达而生产纤维素结合结构域(CBD)。

在本发明之前，在芽孢杆菌中表达CBD是非常不如人意的，因为，首先，已知纤维素结合结构域含有二硫桥，其次，纤维素结合结构域对由芽孢杆菌宿主产生的蛋白酶的降解可能比较敏感。

据此，本发明的第一个方面涉及转化了包含编码纤维素结合结构域之DNA序列的载体、并且能够表达该DNA序列的芽孢杆菌宿主。

在第二方面，本发明涉及一种芽孢杆菌表达载体，所述载体携带有编码纤维素结合结构域的一段插入的DNA序列。

另外，在第三方面，本发明涉及在芽孢杆菌宿主细胞内生产纤维素结合结构域多肽的方法，该方法包括以下步骤：--在营养培养基中，可以过量生产纤维素结合结构域的条件下，培养芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞已转化了包含可操作性地连接在一起的以下诸成分的表达盒：a)转录和翻译起始调控区，b)编码纤维素结合结构域多肽的DNA序列c)转录和翻译终止调控区，其中所述调控区在该宿主中具有功能，和d)用于选择已转化宿主细胞的选择标记基因；和--回收纤维素结合结构域多肽。发明详述

纤维素结合结构域(CBD)是一种可结合纤维素和几丁质的水不溶性形式(包括晶态形式)或与它们有高亲合力的多肽。

已发现CBD是由2个或多个不同多肽结构域组成的大蛋白质复合物的整合部分，例如存在于水解酶中，所述水解酶通常包含一个含有用于底物水解的活性位点的催化结构域和一个用于与不溶性基质结合的糖类结合结构域或纤维素结合结构域(CBD)。这样的酶可以包含一个以上的催化结构域和一个、两个或三个CBD，还可选择性地包含一个或多个将CBD与所述催化结构域连接起来的多肽区，后一类型的区域通常被称为“接头”。包含CBD的水解酶的例子有：纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和几丁质酶。也已经在藻类中，例如在红藻Porphyra purpurea中发现了非水解性多糖结合蛋白形式的CBD(参见Peter Tomme等人(1996))。但是，大多数已知的CBD来源于纤维素酶和木聚糖酶。

在本发明中，术语“纤维素结合结构域”与Tomme等人(出处同前)中的含义相同。其中将120种以上的纤维素结合结构域划分为10个家族(Ⅰ-Ⅹ)，它们可能在底物结合机理方面具有不同的功能或作用。然而，在进行本发明的工作中，已发现了一种迄今为止尚无人知晓的CBD家族，参见下述的实施例8；估计在将来还会出现新的家族代表和其它CBD家族。

在蛋白质复合物(通常是水解酶)中，CBD位于N或C末端或位于内部。

CBD单体通常由约30个以上且约250个以下的氨基酸残基组成。例如，归类为家族Ⅰ的CBD由33-37个氨基酸残基组成，归类为家族Ⅱa的CBD由95-108个氨基酸残基组成，归类为家族Ⅵ的CBD由85-92个氨基酸残基组成。因此，CBD单体的分子量通常约4kD-40kD，并且通常低于约35kD。

CBD可作为单一结构域多肽使用，或作为二聚体、三聚体或多聚体使用，或作为蛋白质杂合体的一部分使用。嵌合蛋白杂合体