[发明专利]用于产朊假丝酵母转化的方法和材料

说明书

技术内容

本发明涉及基因工程和生物技术领域，特别是涉及用于酵母菌产朊假丝酵母(Candida utilis)的遗传转化的一种宿主载体系统的建立，该系统允许异源蛋白质在该酵母菌中表达和分泌，其还可用于多种目的。

现有技术

基因工程和生物技术已经使许多用于医学、营养学或工业目的之目标蛋白质的生产获得了未曾预料到的进展，据报道获得了很好的效益。

基于对大肠杆菌遗传学的了解、它的易操作性和它们的高密度培养系统，大肠杆菌已经被许多生物技术公司作为用于这些目的的最常用的微生物。

但是，期望的该微生物产生的目标蛋白质的产量受到多种因素的影响。首先，当试图将所获产物作为人用药品或食物时，大肠杆菌细胞壁上的热原和毒性化合物限制了其的应用。另外，在大肠杆菌中过度表达的蛋白质通常是以一种不能被分泌的不溶解的形式存在。另一方面，转录、翻译和翻译后修饰的机理不同于真核系统，导致重组蛋白质在特定的方面不同于天然来源的蛋白质。

在真核系统如酵母菌中表达异源蛋白质的可行性相对于原核表达系统有一些优势。其中涉及生长至高细胞密度的能力以及调整它们以适合于连续系统培养的可能性。而且，与大肠杆菌相比酵母菌可将相当大的量的蛋白质分泌到培养基中，而且用于培养酵母菌的培养基比培养细菌所用的培养基更经济(Lemoine,Y.,1988.酵母菌中的异源表达(Heterologous espression in yeast)第八届国际生物技术研讨会(8thInternational Biotechnology Syposium,)Paris,July 17-22)而且，这些系统能够进行其它的转录后修饰，如细菌系统不具备的糖基化作用(Fiers,W.,1988.微生物中外源基因的最大工程化表达(EngineeringMaximal Expression of Heterologous Gene in Microorganism.)第八届国际生物技术研讨会(8th International Biotechnology Symposium,)Paris,7月17-22)。另外，这些系统一般优选使用与更高等的真核系统所用的相同密码子(Kigsman,S.M.等人，1990.酿酒酵母中的异源基因表达(Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae)生物技术与基因工程回顾(Biotechnology & Genetic Engineering Reviews),3,G.E.Russell编)。

所有这些导致了新的真核转化系统的发展和普及，并且尤其令人感兴趣的是在酵母菌中，最先被描述是酵母属(Saccharomyces)的一些种，特别强调的是在酿酒酵母中。但是，酵母属中的蛋白质表达面临一些问题，即用它们的同源启动子得到的表达水平以及分泌到培养基的蛋白质的过度糖基化现象。这就是过去几年加强寻找非常规的酵母菌以用于表达异源蛋白质的主要原因。

随着在其它非酵母属酵母菌中转化系统的发展，象多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)和克鲁维酵母属的酵母菌(Sudbery,E,1994.酵母菌(Yeast)10:1707-1726)已经在这些系统的发展和了解方面有了很快的进展，并且用这些系统表达的用于疫苗、诊断和工业目的的外源蛋白质的种类也不断增长。

而且，已经报道了假丝酵母属中的几种转化和表达系统，包括热带假丝酵母，博伊丁假丝酵母(Candida boidiini),Candida glabrata，近平滑假丝酵母，Candida maltosa和白假丝酵母，这些菌种都有明显的医学方面的用途，因为其中的很多种有可能是人类疾病的病因。

因为假丝酵母属中产朊假丝酵母具有特别的特征，对它有着特殊的兴趣。首先，产朊假丝酵母可利用种类繁多的廉价碳源如木糖、蔗糖和麦芽糖等。另一有趣的特点是在连续的培养体系中它可有效地产生大量的细胞。而且，产朊假丝酵母和酿酒酵母以及乳酸克鲁维酵母作为安全的食物材料的来源已经被FDA(食品及药物管理局)认可。此外，产朊假丝酵母已经被用于L-谷氨酰胺、etil乙酸盐和转化酶以及其它产品的工业生产中。