[发明专利]新构建的L－天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养

权利要求书

1.一种产L-天门冬酰胺酶的工程菌，其特征在于：

1)该工程菌是由重组质粒pASN在三种宿主菌TG1、JM105、IM602分别转化而得，

2)该工程菌在合适的培养基、合适的培养条件下，具有强的产L-天门冬酰胺酶的能力，其酶活力为120-228国际单位/毫升发酵液，

3)该工程菌产生的酶不同于已有的大肠杆菌K-12，酶的分子量为144000，由四个相同亚基组成，亚基基因全长为1044bp，其中有33个碱基不同于大肠杆菌K-12，所编码的氨基酸中Ala₂₇和Asn₂₆₃有差别。

2.如权利要求1所述的工程菌重组质粒pASN，其特征在于是由以下方法构建的：

1)从产L-天门冬酰胺酶的原始菌株E.coli IM-602分离提取染色体DNA，

2)用PCR方法从上述染色体DNA中钓取酶的基因，

3)将酶基因连接在表达质粒pBV220上。

3.如权利要求2所述的酶基因与表达质粒连接的方法，其特征在于：

1)PCR所采用二个引物是根据与表达质粒pBV220中EcoRI和SalI的酶切位点相匹配而设计的，并在EcoRI位点后设置起始密码子ATG，

2)酶基因的5’端连在表达质粒EcoRI位点上，3’端连在SalI位点上，从而构成重组质粒pASN。

4.如权利要求1所述的工程菌合适培养基是指含5-10％(W/V)的玉米浆，0.1-0.5％(W/V)酵母膏，0.1-0.5％蛋白胨，pH7.0-7.5。

5.如权利要求4所述的工程菌合适培养基是指含7.5％(W/V)的玉米浆，0.1-0.5％(W/V)酵母膏，0.1-0.5％蛋白胨，pH7.0-7.5。

6.如权利要求1所述的工程菌合适培养条件方法，其特征在于接种量0.5-3.0％，起始培养温度28℃-30℃，培养4-10小时，生物量达到A₆₀₀2.0-4.0，然后42℃热诱导2-6小时，可得到L-天门冬酰胺酶酶活力为120-228单位/毫升的发酵液。

7.如权利要求1所述的工程菌合适培养条件方法，其特征在于接种量0.5-3.0％，起始培养温度28℃-30℃，培养4-10小时，生物量达到A₆₀₀3.0时，然后42℃热诱导3-4小时，可得到L-天门冬酰胺酶酶活力为120-228单位/毫升的发酵液。

8.一种用权利要求1所述工程菌所生产的酶，其特征在于该酶的分子量为144000，由四个相同亚基组成，亚基基因全长为1044bp，其中有33个碱基不同于大肠杆菌K-12，所编码的氨基酸中Ala₂₇和Asn₂₆₃有差别。

9.一种如权利要求1或8所述工程菌生产的酶在制备白血病医药方面的使用，其特征在于：在含5-10％(W/V)玉米浆、0.1-0.5(W/V)酵母膏，0.1-0.5％蛋白胨及pH7.0-7.5的基质中，接种0.5-3.0％(V/V)的工程菌，在28-30℃培养4-10小时，然后42℃热诱导2-6小时，得到L-天门冬酰胺酶酶活力为120-228单位/毫升的发酵液，继而纯化所得制剂用于治疗白血病。