[发明专利]新构建的L－天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养

说明书

本发明是关于新构建的L-天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养方法。

本发明是利用现代生物技术、基因工程方法来构建工程菌，并选择合适的培养基及培养方法使得到的酶活力达到最高水平。

L-天门冬酰胺酶[E.C3.5.1.1]，也称L-天门冬酰胺基水解酶，能专一地催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨。

1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用，到了六十年代，Broome证实了豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感肿瘤细胞氨基酸、蛋白质和核酸代谢的紊乱，从而抑制肿瘤生长。1964年，Mashburn从大肠杆菌分离得到该酶，从此开始了从微生物中提取L-天门冬酰胺酶，进行生产及临床的研究。许多临床资料表明L-天门冬酰胺酶对急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性变慢性白血病以及若干实质性肿瘤有肯定的治疗作用，特别对儿童急性淋巴细胞白血病有很好的疗效。

我们实验室于1970年开始L-天门冬酰胺酶研究，筛选出一株高产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌菌株，经过发酵培养条件试验，酶活力达到4.6iu/ml，以后进行纯化、工厂中试、纯化酶制剂的动物试验、临床试验，在1973年通过了鉴定，并开始在天津生化制药厂进行生产，在医院里得到了应用。

此后，我们用甲基戊二醇方法获得了该酶的结晶，并对该酶作了一系列的性质试验，酶的分子量是144000，由四个相同的亚基组成，单独的亚基不具备酶活性，酶的等电点是pI 4.6，酪氨酸残基是该酶活性的必需基团，处于该酶分子的活性部位，对酶分子的N-端氨基酸组成进行了分析。虽然，L-天门冬酰胺酶已使用多年，但在治疗白血病方面，该酶仍被认为是一个有效的药物，只是在应用中产生了一些问题，如：作为异体蛋白的酶的长期使用会刺激免疫系统，对人体产生有害的免疫排斥反应，酶在人体中不稳定性，半衰期短；更为重要的是，菌种产酶活性低而引起酶制剂成本太高，一般病人根本承受不起，这些问题不解决，就会大大限制了酶的广泛使用。

提高菌种产酶能力，可以用多种方法，包括重新筛选优良菌种、通过传统的物理化学的方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酶能力等。但是通过国内外专利及文献检索，发现的基因工程方面的报道很少，还没有用工程菌来生产该酶。英国的PublicHealth Laboratory Service Board的Atkinson博士从欧文氏菌(Erwinia chrsyanthemi)的DNA基因库中筛选出L-天门冬酰胺酶基因，构建的重组质粒pASN30，在大肠杆菌和欧文氏菌中进行表达。酶的表达量仅为可溶性蛋白的5-6％，酶活力最高只有20iu/ml，该酶的亚基分子量为32000，等电点pI8.5(EP211639)。美国Purdue大学的Harms博士也构建了产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌工程菌(Protein ExpressionPurification，1991 2(2-3)，44-50)。所分泌出的酶占细胞可溶性蛋白的10-15％。每立升发酵液能得到10-15mg酶。在国内，中国药科大学的刘景晶等人先后构建了二个产L-天门冬酰胺酶的工程菌。在第一个工程菌中，产酶量仅为6.2-31.8iu/ml，酶蛋白占28.3-35.7％(药物生物技术1995，2(4)8-15)。而在第二个工程菌中，使用了同一个酶的基因来源，但构建在不同的表达载体里，使表达水平有了很大提高，在LB培养基里，能达到106iu/ml。只是在1.5L的生物反应器，酶活力高达400iu/ml。酶蛋白占菌体可溶性蛋白48.3％。酶的分子量为140000。(中国药科大学学报，1996，27(11)696-700)。但这些工作离酶的生产应用仍有很大一段距离，因为所采用的表达质粒含Tac启动子，需要有价格昂贵的IPTG诱导及氨苄青霉素作为选择标记，而在大规模生产时，加上IPTG和氨苄青霉素显然是不合适的。

本发明的目的是构建一株高产L-天门冬酰胺酶的工程菌，其发酵培养基易得，培养方法简单可行，不需化学诱导剂诱导及氨苄青霉素作为选择标记，易于工业化生产，产酶能力强，从而大大降低生产成本，提高经济效益。

本发明的L-天门冬酰胺酶工程菌的构建及发酵培养方法，包括如下一些工艺步骤：从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA、引物设计和用PCR方法钓取酶的基因、基因序列测定及重组质粒的构建、重组质粒在几种宿主菌中表达、工程菌的发酵培养。本发明重组质粒的构建及工程菌的培养方法的上述各步详细内容如下：1.从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA