[发明专利]高甜度莫奈灵DNA序列及高效表达所述DNA序列的方法

说明书

本发明提供了采用基因工程技术提高莫奈灵(monellin)甜度和发酵生产高甜度莫奈灵([Asn⁶⁶]monellin)的方法及其应用。

本发明还提供了人工合成编码高甜度莫奈灵的基因，以及携带该基因的表达载体和含有表达载体的重组细胞，及其由重组细胞高效生产的高甜度莫奈灵蛋白及其应用。

莫奈灵甜蛋白来源于西非一种热带植物(Dioscorephyllum cumminsii)的果实(Morris，J.A.，Cagan，R.H.，Biochim.Biophys.Acta，261：114-122，1972)，是一种天然蛋白质甜味剂。莫奈灵甜蛋白在许多方面优于蔗糖和其他甜味剂：(1)莫奈灵不含碳水化合物(Morris，J.A.，The Journal of Biological Chemistry，241(2)：534-539，1973)，代谢产生的热量低。(2)莫奈灵甜度高，按重量比其甜度是蔗糖的3000倍，按分子比计算则为蔗糖的10万倍(Kim，S.H.，deVos，A.M.，Trends in Biochem.Sci.13：13-15，1988)，是现有甜味剂中甜度最高的一种。(3)莫奈灵是天然蛋白质，富含多种氨基酸(Morris，J.A.，TheJournal of Biological Chemistry，241(2)：534-539，1973)，营养丰富，因对人体无任何毒副作用，不仅老幼正常人可直接食用，而且糖尿病人、肥胖病人、心脑血管病人和儿童龋齿病人皆可直接食用。(4)莫奈灵对细菌作用的稳定性高，不会导致龋齿。(5)莫奈灵是一种增香剂，尤其对天然香料，效果更明显。在食品、饮料、医疗保健等方面有广泛的应用前景，是一种很有前途的甜味剂。

但作为莫奈灵天然来源的植物正常结实所要求的生态环境非常苛刻，很难在其他地区引种成功；另外，天然莫奈灵由A、B两条多肽链组成，稳定性较差，低pH或高温条件下，A、B两条多肽链易分开，而失去甜味活性。生物工程技术的迅速发展启发人们用基因工程的手段去改造和开发莫奈灵，实现其在生产和生活中的广泛应用。

1989年，Kim等人用一小段DNA序列将编码A、B链的基因连接起来，并使其成功的在大肠杆菌中表达，单链莫奈灵(single monellin)与天然莫奈灵相比，两者甜度接近，但前者稳定性和复性能力较后者都有显著提高(United States Patent 5264558)。1992年，Penanubia等得到转单链莫奈灵基因的番茄和莴苣，但莫奈灵表达效率较低(Penarrubia，L.，Kim，R.，Giovannoni，J.，Bio/Technology 10：561-564，1992)。1995年，郭三堆等采用原核生物偏爱密码子合成单链莫奈灵基因，使其在大肠杆菌中得到高效表达，莫奈灵达菌体可溶性蛋白的20％，表达效率较低。1996年，Kondo.K.等使单链莫奈灵基因在酵母(Candida utilis)中表达，表达效率高达50％(Kondo，K.，Miura，Y.，Sone，H.，NatureBiotechnology 15：453-457，1997)，为莫奈灵的规模生产和应用创造了条件。以上所涉及的人工改造的莫奈灵基因产物，甜度均为蔗糖重量甜度的3000倍。本发明人工合成的高甜度莫奈灵基因产物是蔗糖重量甜度的4500倍，在蛋白质结构上与上述人工改造的莫奈灵有所不同。

1990-1992年间，Kohmura对天然莫奈灵的结构和功能进行研究，用固定相合成法分别Asn²⁶monellin甜度与天然莫奈灵相比，分别由原来蔗糖重量甜度的3000倍提高到了5500倍和7500倍(Kohmura，M.，Nio，N.，Ariyoshi，Y.，BioSci.Biotech.Biochem.，56(3)：472-476，1992)，由此可见，用固相合成法可以得到高甜度莫奈灵，但这种方法与本发明在细菌中生产高甜度莫奈灵的方法相比较成本太高。

本发明的目的是在前人工作的基础上，不仅要提高莫奈灵蛋白的甜度，同时要建立一种简便、快速、可大规模生产廉价高甜度莫奈灵的方法及其产物的应用。

本发明提供的高甜度莫奈灵蛋白，将天然莫奈灵的A链和B链合并成一条单链，其间加入了具有弹性弯曲特性的氨基酸，并将第66位Asp设计为Asn，从而既维持了与天然莫奈灵相似的空间结构，又提高了所表达甜蛋白的效率、稳定性和甜度。