[发明专利]改进的差异展示聚合酶链反应方法无效
| 申请号： | 98112922.6 | 申请日： | 1998-07-22 |
| 公开（公告）号： | CN1242431A | 公开（公告）日： | 2000-01-26 |
| 发明（设计）人： | 崔大祥;闫小君;苏成芝 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/10 |
| 代理公司： | 西北地区军队院校专利事务所 | 代理人： | 秦红 |
| 地址： | 710032 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 改进 差异 展示 聚合 反应 方法 | ||
1.改进的差异展示聚合酶链反应方法，其特征在于：采用Liang与Pardee改进的第三代DD-PCR引物，建立了差异展示聚合酶链反应的优化条件：5’端引物为8条，每条由13个碱基组成；3’端引物为3条，每条由16个碱基组成，上下游引物Tm值皆为38℃最适起始温度为54.5℃，循环条件为：前五轮循环采用94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S，后35个循环采用94℃ 35S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min。
2.根据权利要求1所述的改进差异展示聚合酶链反应方法，获取了七个在胃癌中呈高表达的新序列，同时筛选出在胃癌组织中检出符合率为100％的五对引物，GCYS-1序列(AF071052)，AP2与D-T11G为引物： 5’AAGCTTCGAC TGTGAATGGA ATGTTGTGGC GTGTCTGGAT CGTATGTCTG TTCTGTGCCA GATGAGCTGT
CAGTCCAGTT CCAGCCTGAC TCGCAGTTGG CTACCGGATC GCTATCCGCG ATGGCTGGAC
CAGGACGATC GATCGAGTCG ATCTGGCAGT CTTGATCCCT TGGACTGTGG GCCGACGACA
GTCGCGGATC GATCCGAGCG CGCGATCCAG CAGGCTGGTC GATCGGTTCT GGTCGGTCTG
CAGCAGATCG GATCGATCGC CATCTCGTCG GTGGATCCTG TCAGCCTGGT GTATTTGTGC CGG3’GCYS-2序列(AF071053)，AP5与D-T11A为引物：5’AAGCTTAGTA GGCGCCGCCG GACCAGCGGA CCGGGGCCGC TTTGCACCAG CAGCGCCCGTGGGCACCAGC CAGCCACTCG CGTCCCCGTA CAGTAGAGCT TGATCCTGGA CTGCTGCGCGGACACGCCTG GGCGGTAGGC GCACGGGACA GTGTCAGTC TGCAACTACC ACGGTGTCGGCGTGAGCCAA GGGCTAAGCC CATCTGACCG GGACGGCCGC TGCGTGTCCAACGGAGTGGG GCGGCTAACC AGGACCTTAC GGGCCCTAAG ATACTCGAGG ATCGGGCCCTAAGAGGAACGCCCGGTAAGA CTCCTCTGGC TGGCTGCCTA AGGCCCTAGC TGGCCTATAG ACTCGTACTCTCTCCTAGAG CCGGCCTTAG CAGTAGCGCG TAAAGCCTAA GACTGGCCTT AGGTGACTGAAGGGCAGAGT AGAGCTAGTT AAGTTCAAGA CTGAGTTAAA GCGATTACGT AGACCTAGAATCAAGGATCC TTAGGTGACT GAAGGGCAGA GTAGAGCTAG TTAAGTTCAA GACTGAGTTAAAGCGATTAC GAGACCTAGA ATCAAGGATC TTAGACCAGA CCTGGGAAGC TGGTTACCTGGGATCCTGTG C3’GCYS-3序列(AF071054)，AP7与D-T11A为引物：5’AAGCTTAACG AGGGACAGAC CTGTCGCCGC GGCTCGCGAC GGCTAGCTGC ACTGCTGCCTGTCCGAGTCA GTCGTCGTCG ATCGCCTTGG GCCTTCTCGG CTTGTGGCGG AGTGCTCCGTGTGTGGCTAC TACTTCTAGG ATCGCTACGC TGGTACTAGC TAGCAGCCGC TACTCGGCCCTAGCTGACTG ACGATGCTCT CGTCGGAGTA GGCAGTCAGC TCTGGTCAGC GTCATATCATCCAGTCCATC GGTCATGCTA GACTCTGCTA GCTCTCTGCA TGTCTGTCTC TCGATCAGGATCAGTCGGCG ATCGGTATCT TGTTCCTTGC CCAGCCATCG ATCTCCTGGC AATACGCCTCAGCCTAGCAG ACCGCCTGCA GGTACCGGTC CGGAATTCCC GGGTCTGGAC CGTCCGCGGACGCGTGGGTT ATCTGTCACA ACTGAAGTCC CCATTAGATA AATCTAGAAC CAAATGTTAGATAAGCACAT GTCCGGCCCA GAAAAGAGAG AAAGTTAAAA AAAAAAAAAA3’ GCYS-4序列(AF071055)，AP3与D-T11C为引物： 5’AAGCTTTTAC CGCCTAGCCA GGACCAGCCA GCCGGAGACC GGAGTCCGAG AGACGCAGAC AGCAACAGACGAGAGACAGC CAAGGTACGA TCAGCAGCAC CAAGCCAAGA AGCCTAAAGA GCAGTCAGAC CTGACTGCAGCAGCACGCTC GCACTCGCCA GAGCACAGCA GCACTGACAC AACTACAGCC ATAGCGAGTC ATAGACAACACCCAACACAC TAATCCTATC TAATTTGGCC CACTCCTC3’GCYS-5序列(AF071056)，AP8与-T11C为引物：5’AAGCTTTTAC CGCCAACCCA CACCAACAGT CCAGCCAAAA AAAATTAGTT CGTGACTTGC ATGAGCGATG CTAGCACTAG ACTGACTGAAG CGGCAACTGC AGGTCCGAAG TCGTCTGAGT ACGTCCGCAG ACAGTCTTGG ACGGCTATGAC GGTCGCATGC AGCGTGTACG TGTGTGGTGT GGTAGAGCTG CCGCGCTTTG TGTGTGTTGTTGTGTGTGTG TGTGTTATAT CGAGCGGTGG TAAAGTCTGA CACCATAACA CTTTAAAATA TTGTATTTATTCATTCAAAA TTCATTGAAA AATCACATGC TATTATATAT TAAAATTATG TGATTATTTT ACAAAATTAG ACTTACAGAA AAGAACTATT TCCTACCCAA AAAGCTGTTAT GGTTATATGC AGCATGTTTTGAAAAAAAAAAAAAAA 3’GCYS-6序列(AF071057)AP7与D-T11C为引物：5’AAGCTTAACG AGGTCCCCGT GATGCAGCTG CCCCGGGCAC CGACCAGCGA TGTGCTCTCA GCCCCCGACA GGTTTCCTGG AAGATGGCGC CATTCTGGAT GATGCGGGGG CACTTGCGGT AGAAGACACG CACGGCGATG AGGGACATGC AGCCGCCATA GTCCTGGAAG CCAGGTAGAA GCCGCTGCGG TGACACAGGT CCGAAGCTCC GCACCTCGGT CGTTGACGTT TCATGACGGC GGCCACCTCA GGTCCACCTG GGAGAAGCTC TCGTCGGCTG CAATGGTATC CACCTTCACC CATGGATTCT CCATCCAGTT GGGGAAGGTT GGGCGTAGTA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGGAAA TTGTATCCGC TCATAATTCC AGACTACATG ACGGAGCCGG AAGCAT3’GCYS-7序列(AF071058)，AP7与D-T11C为引物：5’AAGCTTTGCT CAGCAGATGA TCCTACAACT GCGACACTAT CATGCGCGCT CGCTACTAGA TAAGTCACTCGACAGTGCT ATATTGACTGA CGTACGATCG ACATCGTTGG ACTATCCAGA GTCATTGAAG ATATGTATGGAGTGATTTCA TCTGAAGAAT GACATATCTT TTATGGATCG GACACATTGG TACAGAGACT ACCGGATACGACGACAGACT GATAATTAGG AGCCTTCGAT ACTACTACGA CGTATCGATA CCAGTCAGTC ATCAGGACAACGAGCTGCGA CGTTGGTCGC TTGCATGTCT GCCTATGTGT CTCATCAAGG CACCGGTACG GCACCGCAGTATCACCGATA TTGGAGTACA GGACTTAATC ACG3’筛选出的五对引物：
NO.1 P1 agcagatagtcagacagtcg
P2 gatatgtcattcttcagatg
NO.2 P7 cagactagccgatcatcaga
P8 accggatcagatctgacata
NO.3 P15 taggcagccagccagaggcc
P16 cgttgcactgcagcgcccg
NO.4 P19 acagacctgtcgccgcggct
P20 taggcagtcagctcctggtc
NO.5 P21 cagtagatcctacaactgcg
P22 ctaacgtcgcagctcgttgt
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