[发明专利]改进的差异展示聚合酶链反应方法

说明书

本发明涉及基因的分子生物学

差异展示聚合酶链反应技术即差示PCR技术(mRNA Differential DisplayPolymerase Chain Reaction，mRNA DD-PCR)是一项寻找差异表达基因的新技术，它是对来源背景相同但处于不同状况的组织或细胞进行比较研究并筛选出在不同阶段呈差异表达基因的一种新技术。差示PCR技术要找的是差异表达基因，基因表达水平的变化是最根本的改变，也是相当敏感的改变，它的改变反映了机体的状况，也就是说，机体的不同状况在基因水平上的特征性的代表变化就是表达水平的改变，即差异表达基因的改变。此技术是Liang与Pardee于1992年发明的，建立此技术时的条件为：5’端采用20条引物，每条由10个碱基组成；3’端锚定引物为12条，每条由14个碱基组成；循环参数为：94℃ 30S，40℃ 1min，72℃ 30S，40个循环，最后在72℃延伸5min。实践证明这种方法有效，但繁琐，呈现出的条带太多，假阳性率达70％，后续处理工作量大。1996年，Liang与Pardee对引物进行了改进，5’端引物为8条，每条由13个碱基组成，3’端引物为3条，每条由16个碱基组成，循环条件不变。这种方法也有不足之处，如：差异条带特征性不好，假阳性仍不能消除，重复性不是很好。

本发明能更好地呈现出差异条带，同时能减少非特征性条带的呈现，既保持了呈现效率，又提高了产物的特异性和重复性，克服了假阳性，大大减低了工作量，提高了工作效率。

本发明的技术方案：

采用Liang与Pardee改进的第三代DD-PCR引物，建立了差示PCR的优化条件：5’端引物为8条，每条由13个碱基组成；3’端引物为3条，每条由16个碱基组成，上下游引物Tm值皆为38℃最适起始温度为54.5℃，循环条件为：前五轮循环采用94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S，后35个循环采用94℃ 35S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min。

本发明的优点：

利用本发明在差示PCR中能获得很好的重复性，同时又保证了差异条带的敏感性及特征性，减少了相同条带的呈现，是获取差异表达基因较理想的方法。

本发明的实施例：以胃癌细胞株GC7901与胃粘膜细胞株GES-1为研究对象，采用本发明的方法，分离回收了差异条带154条，胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有82条；胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有35条；胃癌细胞株泳道中表达高于胃粘膜细胞株泳道中的有23条；胃粘膜细胞株泳道中表达高于胃癌细胞株泳道中的有14条；分别来自于H-T₁₁G、H-T₁₁C、H-T₁₁A锚定引物的差异条带为61条、47条、46条。我们从筛出的片段中随机挑取了17个差异条带(命名为GCYS-1至17)作探针，与细胞株GC7901及GES-1总RNA进行打点杂交，结果证实17个片段在两个细胞株之间呈差异表达。采用PCR产物直接测序及全自动测序技术获取了17个差异片段序列，利用计算机网络对序列进行GenBank同源性检索分析，发现七个序列为新序列，获取的序列重新设计了17对引物，利用RT-PCR方法对细胞株、新鲜组织标本、血标本进行了检测。结果表明：通过对GES-1及GC7901细胞株总RNA的检测，证实17对引物皆能从GC7901细胞株中扩出相应产物，其中NO.1、4、8、10、11这5对引物不能从GES-1细胞株中扩出相对应产物。因此，我们选择了这五对引物进一步用于临床标本检测。通过对26例胃癌临床标本检测，发现了这5对引物 (

NO.1    P1 agcagatagtcagacagtcg

        P2 gatatgtcattcttcagatg

NO.2    P7 cagactagccgatcatcaga

        P8 accggatcagatctgacata

NO.3    P15 taggcagccagccagaggcc

        P16 cgttgcactgcagcgcccg

NO.4    P19 acagacctgtcgccgcggct

        P20 taggcagtcagctcctggtc

NO.5    P21 cagtagatcctacaactgcg

        P22 ctaacgtcgcagctcgttgt