[发明专利]氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法

说明书

本发明涉及氨基酰化水解酶法拆分混旋蛋氨酸(D，L-Met)制备左旋蛋氨酸(L-Met)1-2-氨基-4-(甲硫基)丁酸的方法，及氨基酰化水解酶的获取。

氨基酸是构成生物体蛋白质的主要成份，是维持生命的基本物质，而L-蛋氨酸是人体八种必需氨基酸中的一种，对人体的健康起着重要作用。已被广泛用于医药卫生的生化研究，以及氨基酸大输液，食品添加剂，日用化妆品等领域。

混旋蛋氨酸对映异物体中，右型和左型二者除了在使平面偏振光发生不同方向相同角度偏转这一点上的差异外，其它物理、化学性质一般条件下没有差异，因此分离出右型体和左型体是十分困难的，传统的化学拆分法，利用D溴代樟脑磺酸铵与混旋蛋氨酸衍生盐的方法形成非对映体的盐，利用其溶解度的差异，从而达到混旋蛋氨酸拆分的目的，该法要消耗大量的天然樟脑，使用大量的Br、氯磺酸、氯仿等腐蚀性强的化工原料，生产周期长、毒副作用大，而且天然樟脑短缺，生产成本高，因此工业法生产左旋蛋氨酸受到了极大的限制。

特许公报，昭41-22380，昭42-1534公开了氨基酰化水解酶法生产左旋蛋氨酸的工艺，采用米曲酶，用小麦麸-谷壳得到的种曲溶解后的承液外加[Co(H₂O)₆]³119mg/l，与0.17M浓度的乙酰混旋蛋氨酸底物在pH7.0、37℃下作用，以二乙胺乙基作载体，在填充有DEAE纤维的层析柱上，让粗酶液流出通过，流出液减压浓缩过滤得到晶体产品，滤液再用乙醇重结晶，此法优点效率较高，产率67％，菌体培养条件及成本低，酶可反复使用，缺点酶底反应慢，需150小时以上，固化过程中酶失活较高，回收D-乙酰蛋氨酸工序复杂。

特许公报昭48-23915公开了一种氨基酰化水解酶法拆分DL-Met生产L-Met工艺，利用含产谷氨酸棒状杆菌的培养液直接与浓度为0.006M乙酰混旋蛋氨酸底物反应，在pH6.8，温度37℃下反应24小时，反应终止液加热，冷却离心除菌体杂蛋白，上清液经强酸性阳离子柱，流出液为D-乙酰蛋氨酸，柱子用水茚净后，氨水洗脱、浓缩冷却结晶得产品，该方法的优点是效率高，产率64％，单位时间产量相对较高，操作较易，直接使用菌体可省工序和载体，缺点纯度不高，菌体培养成本高，要用肉汁、蛋白冻、葡萄糖培养基培养，回收D-乙酰蛋氨酸工序复杂。

本发明的目的是提供一种氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸新方法，该方法所用的氨基酸酰化酶(E，C、3、5、1、14)具有高活性，易得，生产成本低。

仅L型酰化氨基酸水解

本发明的氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法步骤是：

(1)将乙酰混旋蛋氨酸加去离子水配兑成0.4-1.0mol/L的底物。用NaOH溶液调PH到2-9，优选PH3.8-8，过滤，按3000ml底物液加100-150ml CoCl₂25×10^-4mol/L的溶液。

(2)取氨基酰化水解酶，按17000-20000u/1M乙酰混旋蛋氨酸的比例加入到上述过滤所得底物中，在10-41℃，优选20-38℃，保持40-110小时，进行混旋蛋氨酸拆分。

(3)折分液升温到80-90°，加入活性炭脱色，过滤。

(4)脱色过滤液在70-80℃浓缩到原液体积的1/20-1/30后冷却，

(5)冷却液中加入CH₃OH，其量为底物蛋氨酸重量的6-8倍，搅拌，于0-6℃下结晶3-6小时，离心分离，干燥得产品左旋蛋氨酸。

上述所用的乙酰混旋蛋氨酸的配制按如下步骤进行：

(1)取1份重量的混旋蛋氨酸，加入到有2份重量冰醋酸的反应釜中，边加入边搅拌，

(2)再往反应釜中滴加0.9份重量的醋酐，同时搅拌，待放热反应完毕，此时可蒸馏回收醋酸，

(3)冷却，同时加入2份重量的水，放置冷却≥20小时进行结晶；

(4)结晶分离、洗涤、干燥得m、p114-115℃乙酰混旋蛋氨酸原料。

上述所用的氨基酰化水解酶，即氨基酸酰化酶(E、C、3、5、1、14)是按下述方法制得的：

(1)取1份重量的新鲜动物内脏置于高速捣碎机中在0-6℃下磨成细浆，置于容器中；

(2)往细浆中加入2-3份重量0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液，在0-5℃下搅拌浸提30-40min；