[发明专利]用于将治疗活性物质转移到靶细胞中的组合物及其在基因治疗中的应用

说明书

本发明涉及一种能够用于将治疗活性物质转入靶细胞的组合物，特别是脊椎动物细胞，更具体说是哺乳动物细胞。更具体地说，本发明涉及用这种组合物制备一种载体，用该载体将治疗活性物质，特别是一种多聚核苷酸转移到靶细胞中。

遗传性疾病特别是由于特异基因的异常表达或非功能性突变多肽的表达。例如囊性纤维化被认为是最常见的致死性遗传疾病(1/2000)且平均寿命期望值为20到30年，且该疾病是以粘膜分泌物的大幅增稠，慢性肺病以及外分泌腺-胰脏的功能不全为特征的。所述疾病同电解质转运的紊乱有关，特别是跨跃上皮细胞膜的氯离子，这种紊乱是CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)基因突变的结果(Rommens,科学(Science)245(1989),1059-1066；Rosenfeld,Chest109(1996),241-252)。看起来对这种类型的疾病最合适的治疗方法是将编码有功能CFTR蛋白的基因转入靶细胞以纠正观察到的细胞异常。对于这种方法，也叫基因疗法，几位文章作者认为可选择呼吸道上皮细胞作为靶细胞，这特别地是由于呼吸道上皮的易接近性，尤其可通过肺内运输的方法，例如向肺中滴注。已经证明必须使靶细胞内表达水平达到正常CFTR基因表达量的约5％～7％才能使所观测的电解质转运恢复。类似地，一些出版物描述了通过将基因转入癌靶细胞的技术以消除肿瘤或延缓癌症进一步发展的可能性。已经考虑过一些方法，特别是转移能诱导或激活抗肿瘤细胞介导免疫反应的免疫刺激基因(免疫疗法)，提及的可用于给药的基因可以是编码细胞因子的基因，将产毒素的细胞毒素基因转移到能表达该基因的细胞中，例如1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的tk基因；或者转移抗致瘤基因-即肿瘤抑制基因，例如成视网膜细胞瘤基因或p53基因；或者是能够抑制致癌基因活性的多核苷酸，例如反义分子或能够降解致癌基因特异信使RNA的核酶。

在过去的30年中，已建立了大量将不同异源基因引入细胞，特别是哺乳动物细胞的方法。可将这些不同的方法分为两类。第一类涉及到象微注射，电穿孔或粒子轰击一类的物理方法，这些方法虽然有效，但是在很大程度上限于体外应用，方法的实施是麻烦而棘手的。第二类涉及到分子及细胞生物学技术，将要转移的基因与可促进所述物质转移的生物或合成载体联合起来。

目前最有效的载体是病毒载体，特别是腺病毒或逆转录病毒载体。这些已经开发出的技术是以这些病毒所具有的天然特性为基础的，病毒所拥有的这些特性可使之穿过细胞膜，避免遗传物质被降解并能使其基因组穿入细胞核。这些病毒已经在大量研究中作为实验对象，而且其中有些病毒已经试验性地用作人的基因载体，并着眼于用作如疫苗，免疫治疗或为了补偿遗传性缺陷的疗法。然而，这一使用病毒的方法受到大量限制，特别是由于病毒基因组有限的克隆能力，已经生产的感染性病毒粒子在宿主生物体和环境中传播的危险性，在宿主细胞中因插入而导致人工突变的危险，以及就逆转录病毒载体而言，在体内治疗过程中诱发强烈的免疫反应及炎性反应的事实，因此实际上限制了可以设想的用药方法的数量(McCoy，人类基因治疗(Human Gene Therapy)6(1995)，1553-1560；Yang，免疫(Immunity)1(1996)；433-442)。这许多缺陷，特别是用于人的病毒载体的情况，引导许多机构为转移多核苷酸而开发设计可替代的方式。