[发明专利]一种检测或预测老年痴呆病的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术领域和疾病基因诊断领域。更具体地，本发明涉及一种通过检测是否存在载脂蛋白Eε4等位基因(APOE^*4基因)而检测或预测老年痴呆症的方法，以及用于该方法的试剂盒。

近年来对Alzheimer氏病(即痴呆病的一种)的研究发现，在这些病人的大脑内存在大量异常的老年斑和嗜刚果红血管病变。虽然对这些异常组织结构的生化成分已进行了广泛研究，但它们在导致老年痴呆病中所起的作用却仍然不详。成熟的老年斑是一种复杂的结构，由淀粉样纤维丝的中心核组成，淀粉样纤维丝被营养不良的轴突、轴索末端和树突、小神经蚀质细胞和星形纤维胶质细胞所包围。老年斑淀粉样中心核是一种称为β-淀粉样蛋白(Aβ)的含40-43个氨基酸残基的多肽，周围被血管包围，从而产生嗜刚果红血管病变。通过体内实验发现，β-淀粉样蛋白多肽具有神经毒性[LaFerla et al.Nat.Genet.1995.9：21-29]，可在Alzheimer氏病、唐氏综合症、荷兰型遗传性脑出血和老年人大脑中发现。β-淀粉样蛋白多肽是由正常的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，简称为“APP”)通过裂解产生的。

载脂蛋白E(ApoE)是一种在体内起很重要作用的蛋白，例如：它是血浆脂蛋白的组成成分，参与胆固醇代谢，同时还是肝脏合成的极低密度脂蛋白的成分之一。ApoE蛋白主要有三种异型体，分别为：ApoE2、ApoE3、ApoE4。这三种异型体是人第19号染色体一个基因位点上三个等位基因中任何两个等位基因的表达产物。存在三种纯合基因型，分别为：APOE2/2、APOE3/3、APOE4/4，以及三种杂合基因型，分别为：APOE2/3、APOE2/4、APOE3/4。APOE3/3是最常见的基因型。三种ApoE蛋白的氨基酸组成仅有细微的差别：对于第112位和第158位氨基酸残基，ApoE3蛋白分别为半胱氨酸和精氨酸；ApoE4蛋白分别为精氨酸和精氨酸；ApoE2蛋白分别为半胱氨酸和半胱氨酸。

研究发现，APOE基因和老年痴呆病存在相关性，这是一个非常了不起的研究成果，其中主要有三方面的证据：(1)连锁分析基因定位法发现，第19号染色体的APOE基因区域同老年痴呆紧密关联；(2)脑脊液中ApoE蛋白同β-淀粉样蛋白多肽固定在一起；(3)在老年痴呆病人大脑神经纤维缠结和老年斑中发现了抗ApoE的蛋白。正是这三方面的有力证据，使APOE基因是老年痴呆病的危险因子这一论断得到世界上几乎所有相关实验室的认可。除了和老年痴呆病有关外，APOE基因和老年认知功能减退[Altstiel et al.1997.Lancet 349：1451]、冠心病[Moore et al.1997.Clin.Genet.51：22-5]、胆结石[Bertomeu et al.1996.Gastroenterology 111：1603-10]、糖尿病及动脉粥样硬化[Semenkovich 1997.Diabetes 46：327-34]、大肠癌[Kervinen et al.Gastroenterology 1996.110：1785-90]等也存在相关性。

进一步的研究表明，老年痴呆病人中APOE^*4基因频率显著高于正常老年人。根据这一原理，通过检测到受试人是否含有APOE^*4基因，就可辅助诊断病人可能患老年痴呆或告诉阳性受试人应注意预防老年痴呆。

检测是否是APOE^*4基因纯合子或杂合子的方法有两类，它们分别在核酸水平上直接地或在蛋白水平上间接地进行检测，因而分别称为直接法和间接法。直接法主要是使用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增的限制性内切酶法，直接做基因分型；间接法是通过用等电聚焦法分离ApoE蛋白，再用抗ApoE4蛋白的抗血清进行鉴定，从而间接推测受试人的基因型。