[发明专利]用大规模培养的麻黄细胞培养物作原料生产麻黄碱的方法

说明书

本发明涉及利用生物技术生产麻黄碱的方法。特别涉及，通过利用麻黄细胞的悬浮培养或利用生物反应器大规模培养获得的细胞培养物作为原料，连续或半连续地工业化生产麻黄碱。

麻黄植物中主要含有麻黄碱、伪麻黄碱、L-N甲基麻黄碱、d-N甲基伪麻黄碱、L-去甲基麻黄碱、d-去甲基伪麻黄碱等。麻黄草是一种常用中草药，具有发汗，平喘，祛风等作用。麻黄碱与肾上腺素一样能够兴奋交感神经；但麻黄碱可以口服，且作用时间长，此点为肾上腺素所不能。麻黄碱能使支气管扩张，鼻黏膜收缩，并使血压升高，临床用于特效治疗咳嗽，气喘，枯草热，百日咳等；并能减低月经痛病的疼痛，亦能作散瞳药。

早在1904年，已有人开始研究化学合成法制备麻黄碱。然而，化学合成的方法得到的麻黄碱为消旋的混合物，其中含有等量的左旋和右旋麻黄碱，左旋麻黄碱几乎无医疗作用，且右旋麻黄碱难以从混合物中分离。1921年，Hildebrandt及Klavehn利用Nueberg发明了生物缩合法，能使苯甲酸和乙醛缩合制得1-乙酰基苯甲醇，再与甲胺缩合，再籍活性铝还原，并用胶状铂为接触剂，最后得到1-麻黄碱。这一方法工艺复杂，成本也较高。

目前，麻黄碱的生产是利用天然的麻黄植物进行提取，如全国最大的麻黄碱生产厂一内蒙的赤峰制药厂及国内的大小十几个厂家，都是利用天然植物麻黄生产麻黄碱。这些厂年消耗麻黄植物将近60,000吨左右，几年内麻黄植物即将枯竭。该方法需要耗费大量的天然资源，以保证生产的顺利进行。经过多年的采挖，麻黄植物资源已相当缺乏。内蒙的赤峰制药厂还种植大面积的麻黄植物，但麻黄草的量仍不能满足生产的需要。原因是种植的麻黄植物一般需要3年时间才可收获。种植过麻黄植物的土壤具有毒性，需荒废1—2年方可种植其他植物。并且人工种植需占用大量可耕地。在刘国钧的“新疆麻黄植物立地条件的探讨”新疆植物学研究文集一文中述及麻黄植物群落贫乏，在10×5平方米的样地上只记载5—10个群落，有的只有2—3个群落。另外，新疆麻黄经含量测定，具有工业价值的可利用量仅为蕴藏量的1/3，成本高，产率低。鉴于以上情况，有必要开发生产麻黄碱的其他方法。

本发明的目的在于克服已有的化学合成麻黄碱方法中技术路线复杂和从天然麻黄草中提取麻黄碱的方法需消耗大量麻黄草，而麻黄植物趋于枯竭以及种植占用大量可耕地等缺点，为保护自然资源及生态环境，节约耕地并提高麻黄碱的产量，进行可持续发展的生产，故而提供一种利用麻黄细胞大规模培养，利用细胞培养物生产麻黄碱的方法。

本发明基于从麻黄植物细胞(Ephedra)ZHJ-25的培养物生产麻黄碱，本发明的目的是这样实现的：

1.微生物的名称：麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25：

2.微生物的保藏：麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25CGMCCNo.0359麻黄细胞(Ephedra)ZHJ-25，已于1998年9月23日保藏在中国微生物保藏中心，其简称为CGMCC，保藏的编号为CGMCC0359：

3.微生物的特征：利用麻黄植株诱导出产生麻黄碱的麻黄细胞ZHJ-25，该麻黄细胞有如下的特征：

(1)麻黄细胞的形态特征：

在含有2，4-D和吲哚乙酸的琼脂培养基上于23—26℃培养2天后观察，即可看出细胞在增长，在原有的细胞团上增殖出细小的颗粒状的细胞，再培养3—5天后就可观察到0.5—5mm大小的细胞团。麻黄细胞呈椭球体和球体，细胞的直径大约为10—150微米左右。

(2)麻黄愈伤细织的特征

麻黄的细胞经增殖形成愈伤组织，麻黄愈伤组织有的呈现出聚集体，有的呈现出分散形的状态。愈伤组织边缘呈现类颗粒的波状，微粘。在悬浮培养时呈现1mm左右的细小的颗粒状，悬浮于培养液中，待到生产的后期，由于愈伤组织产生出麻黄碱，细胞的比重加大，细胞易沉降于液体的底部。颜色为浅黄色到深棕色不等。

(3)生理生化特征

可利用多种糖源，最合适的培养温度为25℃，低于10℃或高于40℃细胞生长缓慢甚至死亡。最合适的pH为5.8，在光照及暗培养中细胞均可生产麻黄碱及衍生物，只是麻黄碱及衍生物的含量不同。过氧化物同工酶，是麻黄细胞ZHJ-25生长活性标志，苯丙氨酸转氨酶与麻黄细胞ZHJ-25中的麻黄碱及衍生物的代谢产率成正比关系。

麻黄细胞的特征简述如下表：