[发明专利]骨基质明胶载体的去活方法

说明书

本发明是属于生物医学的材料制备领域，特别适用于骨形态发生蛋白(BMP)的骨基质明胶载体。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，简称BMP)是一种具有独特诱导成骨功能的机体蛋白因子，在机体骨组织再生和修复过程中发挥着关键作用。现在已可从牛、马、猪、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同种属来源的骨形态发生蛋白(BMP)，或利用生物工程技术制备基因重组的人的骨形态发生蛋白(BMP)。利用其诱导成骨活性，有望实现人体断骨的快速再生连接和缺骨的快速再生修复，在骨科和口腔科临床具有广泛的应用前景，并具有重大的经济和社会效益。

为了充分发挥骨形态发生蛋白(BMP)的独特的诱导成骨活性并取得良好的临床治疗效果，需要满足三个条件：一、保证骨形态发生蛋白(BMP)的天然立体构象和双体结构的完整，使其活性不被破坏；二、使骨形态发生蛋白(BMP)与适当的载体复合，为被诱导转化的新生成骨细胞提供附着位点，同时载体还起到缓释和引导成骨方向和范围的作用；三、不引起免疫反应。

骨基质明胶(bone matrix gelatine，简称BMG)是从牲骨中提取的，主要成分是胶原蛋白。它成本低廉并具有良好的生物相容性。由于胶原蛋白组成和结构的高度保守，使其种属差异极小，基本不引起免疫炎症反应，可被人体自然吸收和同化。经过去活处理的骨基质明胶(BMG)本身无诱导活性，并具有多孔网架的微观结构，是骨形态发生蛋白(BMP)的极佳的载体材料。

在牲骨中，天然存在的骨形态发生蛋白(BMP)和其它非胶原蛋白成分与骨基质明胶(BMG)相复合并构成了牛骨基质。为了制备安全实用的骨形态发生蛋白(BMP)载体材料骨基质明胶(BMG)，需要去除骨基质中的骨形态发生蛋白(BMP)和大量的非胶原蛋白组分。这不仅可以得到无诱导成骨活性的惰性胶原载体，而且通过去除大量高种属特异性的非胶原蛋白，得到无免疫原性的骨基质明胶(BMG)载体。所以去活处理是骨基质明胶(BMG)载体的制备中的关键步骤。

现有技术中主要是将牲骨经粉碎并脱脂脱钙后，用高浓度的强变性剂盐酸胍将水不溶性的骨形态发生蛋白(BMP)等非胶原性蛋白溶解抽提去除，水洗去胍后冻干，制成去活胶原载体。详细过程参见U.S.Patent4975526。

上述现有方法在实践中存在的问题主要是由于骨基质颗粒大小差异和盐酸胍抽提效率等因素的影响，为了保证得到无诱导活性的载体，需要长时间的和反复的抽提，并可能在不同批次间存在差异。未被去除的骨形态发生蛋白(BMP)由于双体结构未被破坏，除去盐酸胍后仍可能复性并具有活性；部分与胶原蛋白紧密结合的非胶原蛋白和被包裹其中的骨形态发生蛋白(BMP)蛋白始终难于被抽提去除。

本发明的目的是提出一种能够破坏活性成分的天然结构，提高抽提去活效率，和保证骨基质明胶(BMG)载体的诱导惰性及无免疫原性的去活骨形态发生蛋白(BMP)载体骨基质明胶(BMG)的制取方法。

根据本发明的目的，我们所采用去活处理骨基质明胶(BMG)载体的方法是利用还原剂破坏其分子内和分子的二硫键，破坏其天然活性的空间构象，使双体结构还原成单体结构，使其失去诱导活性并与胶原蛋白去复合，而且还利于被抽提除去。本发明的骨基质明胶载体骨基质明胶(BMG)的去活方法是将新鲜的牲骨股骨去骺端，剔除肌内，筋膜和骨髓后进行脱脂脱水处理，其特征在于脱脂脱水处理是在1∶1的乙醇、乙醚中进行后，并于4℃再进行破碎研磨，过筛，保留75-425μm尺寸大小的组分，1mol盐酸脱钙，水洗至中性后再次脱脂并干燥保存，再将所获脱钙骨基质DBM经2molCaCL₂,0.5mol乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH 8.0,55℃温水顺序抽提(5倍体积，搅拌过夜)后，再采用还原剂与变性剂溶液，按5-10倍体积与DBM混合并于室温下抽提24-48小时。抽提后用8mol尿素洗涤，再用pH5.5的酸溶液于60℃下处理8-12小时，用水充分洗涤至中性，冷冻干燥后，将所得去活骨基质明胶(BMG)粉粒置于4℃保存。在上述本发明去活方法中二次抽提溶液还原剂是指0.05-0.2mol二硫苏糖醇(DTT)溶液或0.7mol β-巯基乙醇(BME)溶液中的任意一种。而与还原剂混合的变性剂是指4-6mol盐酸胍/0.5mol CaCl₂ pH7.0溶液或者说6-8mol尿素/0.5mol CaCl₂ pH7.0溶液中的任一一种。