[发明专利]定向增殖并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法

说明书

本发明涉及一种肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法，更具体地，本发明涉及定向增殖的并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法。本发明还涉及一种新的白介素12(IL-12)的p40亚基基因，该基因来自中国人。

树突状细胞(DC)是新近被认识的最有效的抗原呈递细胞，在其进行抗原的提呈过程中，因其表面表达的淋巴细胞共刺激分子以及分泌的细胞因子，调控着T、B淋巴细胞的分化及功能的发挥，被认为是进行抗原应答的天然佐剂。近年来的研究发现，DC在其早期非成熟阶段，能有效地吞噬其周围环境中的抗原性物质，随后加工处理成抗原性的多肽，呈递给T细胞而激活Th细胞的免疫应答。近年来的免疫学研究还证明，DC也能够通过吞噬外源性的抗原物质，转运到细胞MHC-I类分子的加工途径中，激活机体的CTL反应。由此可以看出DC可作为肿瘤疫苗的佐剂具有较广阔的应用前景。1979年Katz(Nature282：234)直至今日的Frank(Nature Med.4,328-332(1998))等人均采用抗CD34的抗体从骨髓或外周血中分离纯化得到多能造血干细胞，用以培养得到足够量的DC。但是采用抗CD34的抗体的方法存在异种抗原的刺激问题。

机体的CD8+CTL细胞通过识别肿瘤特异性抗原肽而产生的对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用是机体发挥抗肿瘤免疫功能的有效作用因素。然而，特异性CTL的产生依赖于CD4+T淋巴细胞主要是Th1细胞及其所分泌的细胞因子，影响机体Th1细胞分泌的细胞因子主要是IL-12。IL-12是由p40和p35两个亚单位所组成的异二聚体。体外试验发现，IL-12能够促进Th1细胞的分化和特异性CTL的产生，增强特异性CTL和非特异性NK细胞的细胞毒活性，诱导具有重要抗肿瘤效应的细胞因子IFN-γ的产生等作用。在动物试验中发现，IL-12能够使肿瘤的发生过程延缓，乃至使已发生的肿瘤消失，是目前所发现的最有效的抗肿瘤免疫的细胞因子。然而，人体的临床试验发现IL-12具有明显的毒性作用，如发热、转氨酶升高、白细胞减少以及产生对肺动脉的毒性等。因此探讨IL-12的局部应用是目前各国学者研究的重点之一，国外有学者报导，采用IL-12进行自身肿瘤细胞(黑色素瘤)的基因修饰，以此作为肿瘤疫苗用于肿瘤的治疗，收到了一定的疗效。然而，IL-12主要的免疫生物学功能是在抗原的提呈局部影响着免疫细胞的分化与发育。在抗原提呈的局部，抗原提呈细胞(APCs)通过局部所分泌的IL-12能促进Th1细胞的发育与分化，从而有利于特异性CTL的发育与产生。然而，APCs在抗原递呈的过程中自然分泌的IL-12不能有效地拮抗IL-4的作用，致使Th1的发育受到阻碍。动物实验研究表明，在用IL-12基因修饰树突状细胞(DC)后，其负载肿瘤细胞的酸性洗脱抗原对小鼠的保护作用明显高于单纯的DC所负载肿瘤细胞的酸性洗脱抗原，认为IL-12具有很好的免疫佐剂效应，能加强DC细胞递呈抗原的功能。

为实现上述目的，必须在实验中解决以下几个问题：首先克隆中国人自己的IL-12基因，并构建能进行基因转染的IL-12基因表达载体。其次，获得足够量的人DC细胞。第三，具有成熟的能够高效将外源性的基因引入到DC中的可靠方法。本发明人基于于上述研究设想，通过不断努力，终于完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供定向增殖的并表达白介素12的人树突状细胞肿瘤免疫治疗制剂及其制备方法。

本发明的再一目的是提供一种新的来自中国人的IL-12的p40亚基基因。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种含有装载并表达白介素12的人树突状细胞的肿瘤免疫治疗制剂，所述的IL-12的p40亚基基因是本发明人所克隆的新基因，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。本发明的肿瘤免疫治疗制剂的制备方法包括如下步骤：

1)用人干细胞刺激因子(SCF)包被固相载体培养板；

2)获得抗凝人外周血中的单个核细胞，并制成所述细胞的悬液；

3)将所述细胞悬液加到步骤1)的培养板的孔中，于37℃、5％CO₂中孵育细胞1-2小时；

4)洗涤细胞，然后加入含SCF20ng/ml、Flt-3L50ng/ml和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)100ng/ml的培养基刺激粘壁的细胞48-50小时；

5)用含IL-12基因的载体转染步骤4)得到的细胞；