[发明专利]非水介质中稳定的多肽连接酶及制法和用途

说明书

本发明涉及基因工程和酶工程领域，更具体地，涉及适用于非水介质的新的多肽连接酶。

研究表明，枯草杆菌蛋白酶BPN′的活性中心Ser221被Cys取代后，就由水解酶变成多肽连接酶。在这些多肽连接酶中，Subtiligase是目前最好的变体酶，并且已应用于RNase A酶及环肽的合成(Jackson：J.Am.Chem.Soc.1995，117，819-20及Science 1994，266，243-7；Chang：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，12544-8)。Subtiligase这一突变体是BPN′经Ser221Cys/Pro225Ala双突变而得的用于水溶液中的多肽连接酶(Abrahmsen：WO 94/18329；美国专利No.5,403,737；Biochemistry 1991，30，4151-9)。此外，在此(指Subtiligase)基础上还得到了其他一些突变体，但都没有提及这些突变体的稳定性，尤其是在非水介质中的稳定性，得到了提高。

然而，除了在水中进行多肽合成之外，常常还需要在非水介质(尤其是有机溶剂)中进行多肽合成。因此，本领域一直迫切需要能够适用于非水介质的多肽连接酶。

本发明的目的就是克服已有技术中的上述缺点，提供一种在非水介质中稳定性高的、具有多肽连接活性的酶，从而解决多肽连接酶在非水介质中的稳定性差的问题，并有利于提高化学修饰-酶连接工艺中底物的溶解性。

在本发明的一个方面，提供了一种多肽连接酶，它是枯草蛋白酶E的变体酶，其特征在于，它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突变。较佳地，该多肽连接酶还含有选自下组的突变：Asn118Ser，和Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的DNA序列，它编码一种多肽连接酶，该连接酶是枯草蛋白酶E的变体酶，而且它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突变。

在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，它含有上述的编码本发明多肽连接酶的DNA序列。此外，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞被上述的表达载体所转化。

在本发明的另一方面，提供了一种生产本发明的新型多肽连接酶的方法，该方法包括步骤：

(a)将编码该多肽连接酶的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成多肽连接酶表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转化入宿主细胞；

(c)在适合表达该多肽连接酶的条件下进行培养，从而表达出该多肽连接酶；

(d)分离纯化出该多肽连接酶。

在另一方面，提供了本发明多肽连接酶的用途，它被用于非水介质中的多肽连接反应。

此外，本发明还提供了分离纯化本发明多肽连接酶的新工艺，它包括：将发酵上清用30％-60％硫酸铵沉淀，沉淀物用pH6.0-7.4的磷酸缓冲液溶解后经DEAE-Dextran A-25柱和Acrylex P-150柱。

在所附的附图中，

图1是本发明的一种变体酶BHG在60℃，60％DMF中的稳定性曲线图；

图2是在不同浓度的DMF下，变体酶BHG活性曲线图；

图3是在不同浓度的DMF下，本发明另一种变体酶BW活性曲线图。

本发明是基于以下意外发现的基础上完成的：将枯草(杆菌)蛋白酶E中第222位的甲硫氨酸(Met)突变为丙氨酸(Ala)之后，可显著提高蛋白在非水介质中的稳定性。结合Ser221Cys和Pro225Ala(这两个突变将枯草杆菌蛋白酶由水解酶变为多肽连接酶)，就形成了本发明的在非水介质中稳定性高且具有多肽连接活性的连接酶。

在本发明中，“枯草杆菌蛋白酶E”指来自枯草杆菌的蛋白酶E，它可以是天然的野生型的蛋白酶E，也可以是生物衍生或重组的蛋白酶E。天然的野生型的枯草杆菌蛋白酶E的氨基酸序列示于SEQ ID No.3中。

如本文所用，术语“非水介质”指含有有机溶剂的介质，该介质可以是只含有一种有机溶剂，也可以是两种或多种有机溶剂所组成的混合有机溶剂。此外可以是有机溶剂和水的构成的混合溶剂。代表性是有机溶剂有：乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺(DMF)等。较佳地，该非水介质中含有DMF。