[发明专利]表达人白细胞介素12的重组腺病毒及其制法和用途

说明书

本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的表达人白细胞介素12的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。

白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)是目前发现的唯一由p35和p40两个亚基组成、呈异源二聚体结构的细胞因子(Munetti et al.J Exp Med，1993，177：1199)。IL-12主要由巨噬细胞和树突状细胞产生，能有效增强自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)的杀伤作用，促进T细胞增殖和产生γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，而IFN-γ是介导Th1细胞免疫应答的重要细胞因子，因此IL-12被认为是继IL-2之后又一重要的具有免疫增强作用的细胞因子，具有良好的临床应用前景。

动物试验和初步的临床试验表明，IL-12在抗肿瘤(Brnda M，et al.J ExpMed，1993，178：1223)、抗感染和抗呼吸道过敏、纠正免疫缺陷等方面具有显著疗效(Kim J，et al.J Immunol，1997，158：816)。IL-12能抑制受感染的人单核细胞中的HIV的复制(Akridge RE and Reed SG.J Infect Dis 1996；173：559-564)。IL-12还能治疗细胞内细菌感染、病毒性感染和真菌感染。IL-12是一种活性很强的佐剂，体内应用后可以显著增强机体对蛋白抗原或多肽抗原诱导的Th1类细胞免疫反应(主要是CD8⁺CTL)和体液(IgG2a)免疫反应。IL-12可以与抗原类物质一同混合后局部注射，发挥其佐剂样作用。同样，如果IL-12全身性应用，IL-12亦具有显著的佐剂样作用(Marinaro M，Boyaka PN，Jackson RJ et al.Ann N.Y.AcadSci 1996；795：361-365)可以增强粘膜等局部免疫的抗原诱发的免疫反应。。如果在多肽致敏的树突状细胞(DC)体内免疫的同时补充外源性IL-12，可以更显著地激发免疫功能(Bianchi R，et al.J Immunol 1996；157：1589-1597；Bliss J，et al.J Immunol，1996；156：887-894)。

虽然研究表明IL-12有巨大的应用前景，然而，在将IL-12直接用于临床时，仍存在一些问题。例如IL-12的体内半衰期较短，因而治疗时需要每天注射一次或多次，再加上IL-12制剂本身成本较高，所以导致治疗费用十分昂贵而且治疗效率也不高。此外，在局部施用IL-12(如治疗肿瘤时)，需要在同一部位附近反复进行注射，使病人非常痛苦。而且IL-12全身应用的毒副作用严重，导致应用受到很大限制。

因此，本领域迫切需要一种成本低，使用方便的施用IL-12的方法以及相关的制剂。更佳地，还需要一种能有效降低毒性的施用IL-12的方法以及相关制剂。

本发明的目的就是提供一种新颖的在临床上施用IL-12的方法和相关制剂，从而克服现有技术中的上述缺点，使得临床施用IL-12的成本低廉、使用方便、毒性降低和/或效率更高。

在本发明的一个方面，提供了一种表达人白细胞介素12的重组腺病毒，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列，和聚腺苷酸化信号序列。在一个优选实施例中，该腺病毒为Ad5型腺病毒。

在另一优选例子中，该IL-12表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p35亚基编码序列位于IRES之前，而p40亚基编码序列位于IRES之后。

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的表达人白细胞介素12的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂，其中该重组腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列和聚腺苷酸化信号序列。

在本发明的又一方面，提供一种制备表达人白细胞介素12的重组腺病毒的方法，该方法包括：

(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；