[发明专利]细胞内生基因活性化的优化方法

权利要求书

1、改变内生于真核细胞中的核酸序列表达的方法，其特征是，

(a)用第一种载体转移该细胞，其中包括

(i)至少一种选自第一种异源表达控制序列与第一种扩增基因的序列，

(ii)一个正的选择标记基因，

(iii)用于部位特异重组酶的，至少两个位于序列(i)与序列(ii)两侧的目标序列，

(iv)在序列(i)、(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成同源的重组，

(b)在一定条件下培养该转移细胞，在该条件下可形成载体的同源重组，

(c)获得根据步骤(b)制得的细胞。

2、根据权利要求1的方法，其特征是，使用LoxP-序列作为重组酶-目标序列。

3、根据前述权利要求中之一的方法，其特征是，该载体还包括一个负的选择标记基因，它安置于根据权利要求1的(a)(iv)同源序列的外部。

4、根据前述权利要求中之一的方法，其特征是，该定位于重组酶-目标序列之间的核酸序列，通过一个能识别目标序列的部位特异的重组酶的瞬时激活，从细胞的基因组切除。

5、用于同源重组的载体，其中包括

(i)至少一种选自一种表达控制序列与一种扩增基因的序列，

(ii)一个正的选择标记基因，

(iii)至少两种置于序列(i)与(ii)两侧的、用于部位特异重组酶的目标序列，

(iv)置于该序列(i)，(ii)与(iii)两侧的DNA序列，它与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成一种同源的重组，

(v)必要时，一个负的选择标记基因。

6、载体，其中包括：

(i)至少一种选自异源表达控制序列与扩增基因的序列

(ii)一个正的选择标记基因，

(iii)至少两个位于序列(i)与(ii)两侧的重组酶-目标序列，

(iv)必要时，一个负的选择标记基因。

7、真核细胞，最好是人体细胞，其特征在于，

(a)它含有至少一种染色体定位了的序列，它选自一种与内生存在的核酸序列操纵连接的异源表达控制序列与扩增基因，且其中

(b)该序列被重组酶-目标序列置于两侧。

8、一种改变内生存在于真核细胞中的核酸序列表达的方法，其特征是，

(a)用一种载体转移该细胞，包括

(i)至少一种能结合激活蛋白质的核酸序列，

(ii)一个正的选择标记基因，

(iii)置于序列(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的一个核酸截段同源，以便可形成同源的重组，

(b)在一定的条件下培养该转移了的细胞，在该条件下可使载体进行同源的重组，

(c)获得按步骤(b)制得的细胞。

9、根据权利要求8的方法，其特征是，使用至少一种能连接缺氧诱导因子(HIF)的核酸序列。

10、用于同源重组的载体，其中包括：

(i)至少一种能连接激活蛋白质的核酸序列，

(ii)一个正的选择标记基因，

(iii)位于顺序(i)与(ii)两侧的DNA序列，它们与细胞基因组中的核酸截段同源，以便可形成一种同源重组。

11、真核细胞，最好是人体细胞，可根据权利要求8-10之一的方法获得。

12、真核细胞，最好是人体细胞，其特征是，它至少含有异源的、染色体定位的、与存在于细胞中的内生基因操纵结合的、并可与一个激活蛋白质/复合物结合的核酸片段。

13、一种测验在真核细胞中内生存在的、目标基因范围的未编码的核酸序列对该表达影响的方法，其特征是，

(a)用一种载体转移该细胞，其中包括:

(i)一种异源的、在细胞中活性的或可激活的、并与报道基因操纵结合的表达控制序列，

(ii)来自目标基因范围的、在5’部位或/和3’部位上未编码的核酸片段，

(b)在一定条件下培养该细胞，在该条件下该表达控制序列是活性的，

(c)测定报道基因的表达。