[发明专利]细胞内生基因活性化的优化方法

说明书

本发明涉及细胞内基因表达的优化方法，首先，本发明涉及一个改变内生存于一个真核细胞内的目标基因的表达方法，其中借助于同源重组作用，把异源的表达控制序列或/和扩增基因引入到细胞的基因组中，而且该方法中还包括插入的外来DNA的、部位特异重组酶介导的切除，以及用其他的异源表达控制序列或/和扩增基因代替之。本发明还涉及把一个或多个结合到一个激活蛋白质或激活蛋白复合物例如一个缺氧诱发因子(HIF)上的核酸序列通过同源重组，引入到一个真核细胞的基因组内，以便修改目标基因的表达。本发明还涉及一种方法，它通过确定报道基因的表达来测定在5’部位或3，部位上的未编码的核酸片段对目标基因表达的影响。此外，本发明还涉及含有重组酶一一目标序列的DHFR负真核细胞的制备，以及插入到该重组酶一一目标序列中的核酸序列的表达。

细胞中的基因表达可以决定性地，例如对所谓的持家基因，或调节性地进行。尤其是对于必须只在细胞的一个确定的发展阶段中或在环境条件改变时必需进行调节表达。

通过与编码的核酸序列结合的有效启动子，可以在转录水平上调节该表达，并可通过阻遇物及激活剂来调节其活性。使阻遇物或激活剂结合到基因的未编码的核酸序列上，就可以起到降低或提高启动子活性的作用(L.Stryer，《生物化学》，第12章。科普出版社、海德堡，1990年)。另一方面，又可以通过一些因素，例如环境条件来调节细胞中所含的阻遇物或激活剂的量。上述激活剂的实例包括缺氧诱导因子(HIF)，它可以通过减少O₂供给量诱导并导致促红细胞生成素基因表达的提高(Bianchard K.L.等人，人类促红细胞生成素基因的缺氧诱导：启动子与增强子之间的协同作用，它们各自含有甾类受体响应要素，(1992年)，分子细胞生物学，12，5373-5385；Wang G.L.与SemenzaG.L.缺氧诱导因子1的特性及因缺氧造成的对DNA结合活性的调节，(1993年)，《生物化学》杂志，268，21513-21518；Wang G.L.等人，缺氧诱导因子1是一个受细胞的O₂张力调节的基本的螺旋-环-螺旋-PAS异源二聚体(1995年)，美国国家科学院院报，92，5510-5514)。

此外，表达蛋白质的量取决于mRNA的稳定性。用于分解mRNA的酶的识别序列定位于mRNA的3’部位区域中，它们影响mRNA的稳定性及表达高度(Shaw G.与Kamen R.，从GM-CSF mRNA的3’-未翻译区域的保守All序列传递选择性mRNA的降解，《细胞》(1986年)，659-667。mRNA的半衰期与蛋白质的表达量有关。第三级表达调节就是转译。

基因的表达受到复杂调节机理的影响，在个别情况下，它们可以是极有区别的。

可以借助于重组DNA工艺获得蛋白质，其中利用了表达调节的识别(Sambrook等人。1989年《分子克隆》，实验室手册，Cold Spring Harbot)。在这里，使用了载体。它们包含在适合的启动子控制下，给相应的蛋白质编码的核酸序列，以及其他的用于表达蛋白质与复制载体所需的序列。可以根据已知方法，将载体加入到寄生细胞中，接着培养该细胞，并从该细胞或培养介质中获得重组蛋白质。

可以用原核细胞或真核细胞作为上述寄生细胞。原核细胞特别是大肠杆菌细胞在它们的操作中是不存在问题的，然而，在真核细胞蛋白质的重组表达方面则存在一系列的缺陷。

原核细胞与真核细胞的区别在于表达后的加工方式，细胞培养条件，以及在表达加工时参与的陪伴蛋白不同，因此，在原核细胞中制备的真核细胞蛋白质与相应的原生蛋白质相比较有很大的区别。例如，蛋白质的缩并形式与蛋白质的活性可以有所变化。在原核寄生细胞中的蛋白质通常也不能糖基化。然而，在许多情况下，一个正确的糖基化形式，例如在制备用于医药药剂的蛋白质过程中，具有显著的活性与相容性的特征。

因此，可以借用真核寄生细胞或细胞系，例如CHO(中国仑鼠卵巢)细胞，制备糖基化的蛋白质。尽管在使用真核细胞时，由于物种的区别，例如在非人类细胞中表达一个人类蛋白质时，可以在重组制备的蛋白质中出现变化。但是在许多应用方面却是无用的。

在蛋白质的重组制备过程中，可用表达载体瞬间地或稳定地转移寄生细胞。其中，特别是在大规模制备方法中，采用稳定转移的细胞。

在寄生细胞的基因组中的表达载体序列的非特异性随机整合，可以导致细胞生产率的减小或细胞的不稳定性。例如，在生产过程中使生产率下降，或者使细胞表达重组蛋白质的能力完全丧失。