[发明专利]鉴别在G蛋白偶联体系中起作用的植物蛋白的方法和组合物

说明书

发明领域

本发明涉及生物分析技术，该技术利用在宿主细胞系统中表达的植物蛋白来鉴别它们在植物G蛋白偶联系统中的功能，本发明特别适用于鉴别植物G蛋白亚基以及作用方式类似于这些G蛋白亚基和G蛋白偶联受体的植物蛋白。本发明的其他实例涉及表达这些植物蛋白(尤其是植物G蛋白亚基)的宿主细胞，用于制备这类细胞的载体，以及它们的制法和用途。

发明背景

在动物体系中，许多胞外信号的作用(例如神经递质、激素、有味物质和光)是由具有7个跨膜结构域的受体(G蛋白偶联受体)和异三聚体的鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白(G蛋白)所介导的。G蛋白由3个亚基构成：脒基核苷酸(guanyl-nucleotide)结合α亚基、β亚基和γ亚基[综述可参见Conklin，B.R.和Bourne，H.R.(1993)细胞(Cell)73，631-641]。G蛋白在两种形式之间循环，这取决于结合于α亚基的是GDP还是GTP。当GDP结合时，G蛋白以异三聚体即Gαβγ复合物形式存在。当GTP结合时，α亚基解离，留下Gβγ复合物。重要的是，当Gαβγ复合物可操作地与细胞膜上的活化G蛋白偶联受体缔合时，则GTP交换结合的GDP的速度就增加，因此结合的Gα亚基从Gβγ复合物上解离的速度就上升。游离的Gα亚基和Gβγ复合物能够将信号传递给各种不同信号传导途径中的下游元件。这一基本事件构成许多不同细胞的信号传导现象的基础。对于其他信息，可参见H.G.Dohlman，J.Thorner，M.Caron和R.J.Lefkowitz，生物化学年报(Ann.Rev.Biochem.)，60，653-688(1991)。

在植物中，有证据表明大量的植物信号传导途径，其中包括红光和蓝光信号(Warpeha等人，1991；romero和Lam，1993；Neuhaus等人，1993)、对气孔开启的K⁺通道调控(Fairley-Grenot和Assmann，1991；Li和Assmann，1993；Armstrong和Blatt，1995)、以及生长素信号传导(Zaina等人，1990)，都是通过G蛋白中介进行调节的。更具体地，在某些这类研究中，在显微注射GTP类似物GTPγS或霍乱毒素(这两种物质都导致G蛋白被组成型激活)后，测量番茄突变株aureus中红光依赖型的反应，结果发现产生了与显微注射植物光敏色素或将植物暴露于红光时相同的效果。显微注射抑制剂GDPβS或百日咳毒素，可有效地阻断红光依赖型反应。

此外，根据用GTPγS、GDPγS和毒素进行的电生理学研究，已提示抑制性G蛋白可调节蓝光依赖型K⁺通道的开启。在另一些实验中，已表明蓝光可激活豌豆质膜中的GTP结合蛋白。在水稻中，生长素可增进体外GTPγS与小泡(vesicle)的结合，同时GTPγS的结合降低了生长素的结合。这种结合关系提示生长素对G蛋白的激活作用刺激了细胞伸长。此外，有证据表明G蛋白介导植物的防御反应(Legendre等人，1992，Vera-Estralla等人，1994；Beffa等人，1995)。

在大量植物物种中已检测到Gα样蛋白(具有与动物Gα亚基相似的分子量而且被抗动物Gα亚基的抗体所识别)(综述可参见Ma，1994和Kaufman，1994)，而且已鉴别出编码G蛋白α亚基的3个基因。第一个基因是根据动物G蛋白α亚基的保守序列，用PCR引物从拟南芥(Arabidopis thaliana)中克隆出的(Ma等人，1990)。预测的蛋白质具有GTP结合蛋白所特有的鸟嘌呤核苷酸结合与水解的所有保守序列，并且与大鼠Gi(1-3)和牛转导素有36％相同性。将拟南芥基因用作探针，鉴别出了番茄(Ma等人，1990)和大豆(Kim等人，1995)中的基因。拟南芥、番茄和大豆的基因之间有80％以上的相同性，这暗示植物G蛋白α亚基可能是高度保守的。根据Southern印迹分析，拟南芥和番茄DNA似乎是单基因，而在大豆中可能存在多基因。编码G蛋白β亚基的单基因也已从玉米和拟南芥中克隆出(Weiss等人，1994)。预测的蛋白质序列相互有76％相同性，而且与哺乳动物G蛋白β亚基有41％相同性。