[发明专利]细胞色素P450单加氧酶

权利要求书

1.一种编码细胞色素P450单加氧酶的DNA分子，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。

2.根据权利要求1的DNA分子，其中单加氧酶可从产生含氰苷的植物中获得。

3.根据权利要求2的DNA分子，其中单加氧酶可从选自高粱属、三叶草属、亚麻属、紫杉属、海韭菜属、木薯属、扁桃属、李属的植物和十字花科植物中获得。

4.根据权利要求1的DNA分子，其中醛肟是选自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和环戊烯甘氨酸的氨基酸在单加氧酶存在下转化的结果，该单加氧酶催化该氨基酸向相应的N-羟基氨基酸的转化以及该N-羟基氨基酸向醛肟的转化。

5.根据权利要求1的DNA分子，其中单加氧酶催化含氰苷生物合成途径中一种以上的反应。

6.根据权利要求1的DNA分子，它包含应用重组DNA技术所必需的DNA。

7.根据权利要求1的DNA分子，它编码双色高粱的一种单加氧酶。

8.一种细胞色素P450单加氧酶，它催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。

9.根据权利要求8的细胞色素P450单加氧酶，它将醛肟转化为腈的能力依赖于NADPH的存在，这种依赖性可通过还原剂的加入被克服。

10.根据权利要求9的细胞色素P450单加氧酶，如SDS-PAGE测定它具有55kD的分子量，并且具有如SEQ ID NO：3所述的N端序列。

11.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450单加氧酶，

(c)产生针对纯化的单加氧酶的抗体，

(d)用该抗体探查产生含氰苷的植物组织的cDNA表达文库，

(e)分离表达单加氧酶的克隆。

12.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450单加氧酶，

(c)获得该单加氧酶的完全或部分蛋白质序列，

(d)设计特定DNA的寡核苷酸，该DNA编码所述单加氧酶蛋白质序列的4-15个氨基酸，

(e)用该寡核苷酸、或者用通过该寡核苷酸由cDNA经PCR扩增所获得的DNA分子探查产生含氰苷的植物组织的cDNA文库，以及

(f)分离编码细胞色素P450单加氧酶的克隆。

13.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)设计覆盖A型细胞色素P450保守区3-10个氨基酸的简并寡核苷酸，

(b)使用该简并寡核苷酸通过聚合酶链反应扩增一种或多种细胞色素特异的DNA片段，

(c)用细胞色素特异的片段筛查cDNA文库，获得全长的cDNA，

(d)在微生物宿主中表达全长的cDNA，

(e)鉴定表达细胞色素P450单加氧酶的宿主，该酶催化醛肟向腈的转化及该腈向相应的氰醇的转化，以及

(f)从该宿主中纯化克隆的DNA。

14.一种产生纯化的重组细胞色素P450单加氧酶的方法，所述酶催化醛肟向腈的转化及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)人工改造编码该单加氧酶的基因，使其可在宿主生物中表达，

(b)用人工改造的基因转化该宿主生物，以及

(c)从宿主生物或其培养上清液中分离蛋白质。

15.根据权利要求14的方法，其中该宿主生物选自细菌、酵母和昆虫细胞。

16.根据权利要求14的方法，其中产生双色高粱的细胞色素P450单加氧酶。

17.根据权利要求14的方法，其中细胞色素P450单加氧酶被修饰。