[发明专利]细胞色素P450单加氧酶

说明书

本发明涉及通常使用重组DNA技术的植物中的遗传工程，并且涉及参与含氰苷的生物合成的酶，特别是编码这些酶的基因。根据本发明的蛋白质和基因能用来改善植物的营养价值或对害虫的抵抗力。

在超过2000种的植物中，含氰苷构成了次级植物代谢物。在一些实例中它们是HCN的来源，如果作为食物被摄取则其会赋予植物毒性。例如，生氰作物木薯(Manihot esculenta)的块茎构成了热带地区的一种重要的食物。这些块茎中存在的含氰苷可导致人的氰化物中毒，这是由于未充分处理的木薯产物引起的。其它植物种包括白三叶草(Trifoliumrepens)、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))、亚麻(Linumusitatissimum)、海韭菜苷(Triglochin maritima)、利马豆(棉豆(Phaseoluslunatus))、扁桃(扁桃属(Amygdalus))以及杏(李属(Prunns))、樱桃和苹果(Malus)的种子，其HCN的酶源产生说明了当作为食物被过量摄取或用作动物饲料时其潜在的毒性。在这些植物中毒性特性能通过阻断含氰苷的生物合成而降低。

天然发生的含氰苷的初级前体限于五种疏水性蛋白质氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，以及一种单独的非蛋白质氨基酸，环戊烯甘氨酸。这些氨基酸在一系列反应中转化为氰醇，氰醇最终与糖残基连接。例如，苦杏仁苷构成O-β-龙胆二糖苷，野黑樱苷构成(R)-杏仁腈的O-β-葡糖苷。含有芳香族糖苷配基的含氰苷的另一个实例是含氰苷蜀黍苷和taxiphyllin的差向异构体对，其分别见于高粱属和紫杉属中。例如对羟基杏仁腈被UDPG-糖基转移酶转化为蜀黍苷(β-D-吡喃葡糖基氧-(S)-对羟基杏仁腈)。相似的糖基转移酶据认为存在于大多数植物中。巢菜苷和路枯马木苷是类似于苦杏仁苷的二糖衍生物的另外的例子。黑接骨木苷包含(S)-杏仁腈作为其糖苷配基，因此它是野黑樱苷的差向异构体。

含有脂族糖苷配基的含氰苷的实例是在三叶草、亚麻、木薯和豆类中发现的亚麻苦苷和百脉根苷。关于含氰苷及其生物合成的详细评述见Conn，Naturwissenschaften 66：28-34，1979，在此引入作为参考。

已广泛研究了来源于酪氨酸的含氰苷蜀黍苷的生物合成途径(Halkier等人，“含氰苷：生物合成途径与有关的酶系统”，在《生物学中的氰化物》(Cyanide compounds in biology)，Wiley Chichester(Ciba基金会140)，49-66页，1988；Halkier和Moller，植物生理学(Plant Physiol.)90：1552-1559，1989；Halkier等人，生物化学杂志(The J.of Biol.Chem.)264：19487-19494，1989；Halkier和Moller，植物生理学96：10-17，1990；Halkier和Moller，生物化学杂志265：21114-21121，1990；Halkier等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：487-491，1991；Sibbesen等人，在《细胞色素P450的生物化学和生物物理学。结构和功能、生物工程学和生态学方面》，Archakov，A.I.(编)，1991；Koch等人，第8届国际细胞色素P450会议，摘要PII.053；以及Sibbesen等人，第8届国际细胞色素P450会议，摘要PII.016)。L-酪氨酸被转化为对羟基杏仁腈(蜀黍苷的前体)，N-羟基酪氨酸、N，N-二羟基酪氨酸、(E)-和(Z)-对羟苯基乙醛肟和对羟苯基乙腈是中间物。细胞色素P450型的两种单加氧酶参与了该途径。在木薯中，包括依赖细胞色素P450的单加氧酶的相似途径用于分别从缬氨酸和异亮氨酸合成亚麻苦苷和百脉根苷(Koch等人，生物化学与生物物理学档案(Archives of Biochemistry andBiophysics)，292：141-150，1992)。业已证明，在双色高粱中从L-酪氨酸到对羟基杏仁腈的复杂途径仅需要两种依赖细胞色素P450的多功能单加氧酶。第一种酶称为P450_TYR，将酪氨酸转化为对羟基苯乙醛肟。第二种酶称为P450_OX，将醛肟转化为对羟基杏仁腈。鉴于不同植物之间含氰苷生物合成途径的相似性，通常假定该途径包括两种依赖P450的多功能单加氧酶，P450_I和P450_II，它们分别将前体氨基酸转化为相应的醛肟，将醛肟转化为相应的氰醇。P450_I是一种特异酶，它决定底物特异性并因此决定产生的葡糖苷的类型，而预计P450_II在将一系列结构不同的醛肟转化为相应的氰醇方面特异性较低。