[发明专利]青霉素发酵发生的改进方法

说明书

发明领域和背景

本发明涉及一种制备于6-氨基处去酰基化的青霉素的方法，其是在侧链前体存在下发酵青霉素产生菌并将发酵产生的N-取代青霉素脱酰基。

在制药工业中，6-氨基青霉烷酸(6-APA)是重要的中间体，一般通过化学法或酶法对青霉素G或青霉素V的裂解(“脱酰基”)获得。

青霉素本身获自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌株的发酵。在一般的青霉素G回收方法中，将培养液过滤并洗涤，酸化滤液后将青霉素G萃取到乙酸丁酯或甲基异丁基酮中。然后溶剂用活性炭脱色，经钾盐水溶液如乙酸钾中和将青霉素G酸反萃取到水中。此溶液与足量的丁醇混合，通过蒸馏丁醇-水共沸混合物减少水分的含量，形成的青霉素G晶体通过过滤和随后的洗涤并干燥得到回收。

在另外一种方法中，通过添加乙酸钾或其它钾盐并蒸馏共沸混合物直接从有机溶液中获得晶体物质，籍此过滤晶体、用丁醇洗涤、随后过滤并干燥。对于青霉素V，可以应用同样的方法。不过，由于青霉素V在酸性条件下稳定性较好，青霉素V也可以以酸的形式而不是钾盐的形式结晶，而没有经济上无法接受的损失。

6-氨基青霉烷酸(6-APA)一般从溶解的固体青霉素G或青霉素V的溶液中获得，然后溶液分别与固定化的青霉素G酰化酶或青霉素V酰化酶接触。随后，将转化溶液投入结晶器中，在pH大约3.5-4.5时通过沉淀形成固体产品。通常，在此结晶过程中，逐步地降低pH值以避免终产品6-APA被高侧链水平的和有色的化合物污染。此外，加入溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇也可避免这种无法接受的污染。很明显，这几种6-APA的生产路线周期长而成本高。

本发明公开了一种用于生产6-APA的改进方法，其中不需要将青霉素G或青霉素V作为固体中间体分离，而且其中省去了颜色调整措施。

发明描述

本发明公开了一种用于从青霉素产生菌的发酵培养液中生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)的改进方法。

新的生产和纯化方法主要包含以下步骤：

在合适侧链前体存在下发酵青霉素产生菌。过滤发酵培养液，籍此滤液用有机溶剂萃取以获得含有大部分N-取代青霉烷酸的有机相。随后，将N-取代青霉烷酸反萃取到水中。将水相任选地剥离以除去残留溶剂。将剩余的溶液相用酶法处理产生6-APA和一种侧链，如苯氧基乙酸或苯乙酸。

然后，酸化所述溶液，6-APA从转化的水溶液中沉淀，并以一种晶状产品得到分离。不过，更优选的本发明的一个实施方案包含对转化溶液的酸化，以及随后的在通过pH转换使6-APA从水相中沉淀之前先将侧链转移到有机溶剂中的萃取。

根据本发明的方法，下列步骤得到更详细地说明。

含有N-取代青霉素的发酵培养液由任何合适的发酵方法获得，例如来自一株产黄青霉菌在合适侧链前体如苯乙酸或苯氧基乙酸存在时的发酵。

采用任何合适技术从发酵培养液分离菌体，比如离心或过滤，产生一种含有青霉素的发酵液，优选采用过滤步骤实现所述分离。任选地洗涤残留固体。

通过加一种酸，如硫酸、盐酸或硝酸或其组合，将发酵培养基或发酵液酸化到pH2-4，优选pH2.5-3范围内。然后通过萃取到有机溶剂中使N-取代青霉素从酸化的水相中分离。所用的有机溶剂优选乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。合适的去乳化剂的加入可以显著地改善萃取效果。

在本发明的一个实施方案中，部分有机溶剂可以在酸化之前加入到发酵培养基或发酵液中。已发现此法在避免沉淀方面是令人满意的，所述沉淀有时作为酸化发酵培养基或发酵液时不希望的副作用出现。沉淀是不希望的，因为它将导致产品的损失且可以引起随后的操作上的困难。

在下一步骤中，将存在于有机溶剂中的N-取代青霉素于pH6-10，优选于pH7-9反萃取到水中。用于pH调节的碱可以为比如氨水或碱金属的或碱土金属的氢氧化物溶液。

相分离之后，任选地剥离水相以去除有机溶剂。

随后，用合适的青霉素酰化酶处理水相或溶液。