[发明专利]在植物中表达除草剂结合多肽以产生除草剂耐受性

说明书

本发明涉及通过在植物中或植物器官中表达外源除草剂结合多肽制备耐除草剂植物的方法。本发明还涉及编码在转基因植物中有除草剂结合特性的多肽、抗体或抗体部分的相应核酸及转化植物本身的用途。

已知遗传工程方法允许外源基因特异转移到植物基因组中。将这种方法称为转化，得到的植物为转基因植物。目前，转基因植物用于生物技术的许多领域。如抗昆虫植物(Vaek等，植物细胞5(1987)，159-169)，抗病毒植物(Powell等，科学232(1986)，738-743)和抗臭氧植物(Van Camp等，生物技术12(1994)，165-168)。通过遗传工程得到的改良性状的例子有：改良的果实贮存期(Oeller等，科学254(1991)，437-439)、土豆块茎中提高的淀粉产量(Stark等，科学242(1992)，419)、淀粉组分改变(Visser等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296)和脂类组分改变(Voelker等，科学257(1992)，72-74)以及外源高分子的合成(Poirer等，科学256(1992)，520-523)。

植物分子遗传学领域中进行的工作的重要目标是产生除草剂耐受性。除草剂耐受性的特征在于植物或植物器官与所用除草剂的相容性得到改善(就类型或水平而言)。这可通过多种途径实现。已知的方法联合应用代谢基因如pat基因和草铵膦抗性(WO8705629)或抗除草剂的靶酶如抗草甘膦的烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(WO9204449)，并在细胞和组织培养中使用除草剂选择耐受性植物细胞和得到的抗性植物，如在关于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂中描述的(US5162602，US5290696)。

抗体是作为免疫系统组分的蛋白。所有抗体的共同特征是它们的立体球形结构、轻链和重链的构成及其高特异性地与分子或分子部分结构结合的基本能力(Alberts等，在：Molekularbiologie，derZelle[细胞分子生物学]，第2版，1990，VCH Verlag，ISBN 3-527-27983-0，1198-1237)。根据这些特征，将抗体用于多种任务。应用可分为在产生抗体的动物和人体内应用抗体，即所谓的原位应用，和ex-sita应用，即从产生抗体的细胞和生物体分离抗体后应用抗体(Whitelam und Cockburn，TIPS第1卷，8(1996)，268-272)。

用体细胞杂交细胞系(杂交瘤)作为针对十分特异的抗原的抗体源的根据是Kohler和Milstein进行的工作(自然256(1975)495-97)。这种方法允许有统一的结构并由细胞融合方法产生的所谓单克隆抗体产生。免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。这可使杂交瘤细胞无限繁殖。同时，细胞分泌针对免疫小鼠所用抗原的特异性抗体。脾细胞提供产生抗体的能力而骨髓瘤细胞使细胞无限生长并不断地分泌抗体。作为克隆，因为每个杂交瘤细胞来自单个B细胞，产生的所有抗体分子有相同的结构，包括抗原结合位点。因为可以无限得到有单一的、已知特异性和共同结构的抗体，所以这种方法大大促进了抗体的应用。单克隆抗体广泛应用于免疫诊断学和治疗学。

在最近几年中，所谓的噬菌体展示方法已用于制备抗体，避免了免疫系统和多次免疫动物。抗体的亲和性和特异性得到体外测量(Winter等，免疫学年评12(1994)，433-455；Hoogenboom，TIBTech，第15卷(1997)，62-70)。含有编码抗体可变区，即抗原结合位点序列的基因片段与噬菌体外壳蛋白基因融合。然后，用含有这样的融合基因的噬菌体感染细菌。得到的噬菌体颗粒具有含抗体样融合蛋白的外壳，抗体结合区指向外侧。这样的噬菌体展示文库可用于分离含希望的抗体片段并与某抗原特异性结合的噬菌体。通过这种方式分离到的每个噬菌体产生与单克隆抗体一致的单克隆抗原结合多肽。每个噬菌体独特的抗原结合位点基因可从噬菌体DNA中分离到并用于构建完整抗体的基因。

在农作物保护领域，抗体特别用作抗原的质量和数量检测的ex-sita分析工具。这包括在饮用水中(Sharp等，(1991)ACS Symp Ser.，446(Pestic.Residues Food Saf.)87-95)、土壤样品中(WO9423018)或植物或植物器官中植物成分、除草剂或杀真菌剂的检测，并且将抗体用作结合分子纯化的辅助。