[发明专利]通过使用融合蛋白生产酰胺化肽的方法

权利要求书

1.用于生产肽的方法，包括以下步骤：表达作为融合蛋白一部分的肽，然后通过酰基受体如含硫还原剂从融合蛋白上释放肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中至少部分融合蛋白是能催化肽作为酰基部分转移给适当受体如近端硫原子以形成硫代-酯的分子

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中肽从融合蛋白释放出来后在其羧基末端酰胺化。

4.如权利要求3所述的方法，其中酰胺化步骤在适当pH、一定来源的铵离子参与下进行。

5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中酰胺化步骤与肽的释放同时发生。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中肽是鲑降钙素、人降钙素、促黄体生成素释放激素、催产素、胃泌素神经肽Y、血管升压集、促肾上腺皮质素释放激素、生长激素释放激素、人降钙素基因相关肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素细胞刺激激素前体、Sectetin、促甲状腺素释放激素、糊精、P物质、胰多肽、缩胆囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降压肽、肥大细胞脱粒肽M、雨蛙肽或FMRF酰胺。

7.如权利要求6所述的方法，其中肽是鲑降钙素或人降钙素。

8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中融合蛋白包含至少部分修饰的intein序列。

9.如权利要求8所述的方法，其中intein序列或其部分的修饰导致自剪切功能的丧失。

10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中intein序列或其部分来自酵母的VMA1基因。

11.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中肽通过水解从融合蛋白中释放出来。

12.如权利要求11所述的方法，其中肽是Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、脑肽、心房肽或杀菌/通透性-增加蛋白。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中融合蛋白包含可用于通过亲和或其它层析方法进行融合蛋白鉴定和/或纯化的标记。

14.如权利要求13的方法，其中标记是亲和标记。

15.如权利要求14所述的方法，其中亲和标记包含特异几丁质结合区或其部分、酸性或碱性氨基酸的重复、多聚组氨酸序列、谷胱甘肽合成酶和溶菌酶。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中融合蛋白在细菌、酵母、包括所有植物的植物组织、昆虫细胞、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。

17.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在大肠杆菌或枯草杆菌中表达。

18.如权利要求17所述的方法，其中融合蛋白在大肠杆菌中表达并且如果肽在其序列中不包含甲硫氨酸就用溴化氰处理肽。

19.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在酿酒酵母或P.pastoralis中表达。

20.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞中表达。

21.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在转基因马铃薯组织或转基因玉米组织中表达。

22.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在转基因猪、母牛、绵羊、山羊或兔的乳中表达。

23.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在昆虫细胞如草地夜蛾细胞中表达。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中编码融合蛋白的序列也包括分泌前导序列。

25.如权利要求24所述的方法，其中分泌前导序列在分泌过程中由天然加工酶去除。

26.编码如权利要求1、2、6-15、24或25中任一项所定义的融合蛋白的DNA构建体。

27.如权利要求26所述的DNA构建体，是载体形式。