[发明专利]通过使用融合蛋白生产酰胺化肽的方法

说明书

本发明涉及通过重组方法、特别地但不仅仅进行羧基末端修饰如酰胺化作用生产肽的方法。

“肽”是不太准确地应用于通过氨基和羧基末端连接的氨基酸链，专指三到一百以上但也可能更多成分的序列的术语。有许多天然产生的肽的例子作用为激素、信使、生长因子、抗微生物剂、表面活性剂等，也可预期多种医药和其它用途。

目前，至少有三种肽的主要来源，从天然资源中提取、化学合成和来源于用重组DNA构建体转化的有机体。使用转化有机体途径的优点是其合成方法的生物保真性、合成化学上不适宜序列的能力、对化学方法的避免、使用溶剂等，以及特别地对于较长肽的成本-有效性。

通过重组技术制备肽的缺点是所用的有机体在合成以及如果需要分泌短序列氨基酸时显得不理想。所以，许多为工业应用考虑的方法利用了融合蛋白，其中短肽序列制成在另一蛋白上氨基或羧基末端的延伸。尽管这些融合蛋白可大量生产，并常通过采用简化融合蛋白纯化的特殊性质加以纯化，但在回收肽时会遇到困难。蛋白是化学稳定的分子并因此需要特异切割策略以回收具有确定的氨基和羧基末端的完整肽。

可看到一大系列的蛋白切割技术。它们从特异氨基酸处的化学切割到使用序列特异性酶进行酶切。化学切割的实施例包括在甲硫氨酸残基之后用溴化氰切割以及在天冬酰胺-甘氨酸的氨基酸对之间用羟胺切割。适于在特异蛋白序列切割的酶的例子包括可在(天冬氨酸)₄-赖氨酸序列之后进行切割的肠激酶，以及在碱性氨基酸赖氨酸或精氨酸之后进行切割的凝血酶。

这两种切割策略的普遍问题是由于肽中内部位点存在和产生真正氨基末端的需要而发生的序列限制。例如，溴化氰只在肽中没有内部甲硫氨酸时有用，并且凝血酶可在碱性氨基酸后的大量不同位点切割。酶切割从加工经济学角度来看还有其它问题。酶必须来自可接受的有效来源(肠激酶的常见来源是小牛肠道内皮)并能获得经济上可接受的量。

羧基末端酰胺化是在许多具有潜在商业利益的生物活性肽中发现的常见翻译后修饰。例子包括降钙素、爪蟾抗菌肽等。在许多例子如降钙素中，天然酰胺化的肽的活性几乎是非酰胺化肽的二千倍。

有许多不同的化学和物理方法设计用来产生羧基末端酰胺化肽。然而，象任何其它加工步骤一样，每一步从增加终产物的总花费角度考虑都有缺点。

本发明描述了用于在重组系统中生产作为融合蛋白氨基末端延伸的肽的方法。我们提供新的方法，其中肽从融合蛋白上的切割和肽的修饰如羧基酰胺化可在单独的步骤中通过一系列相连接的反应完成。该方法从生物表达系统的低花费和合成保真性获益，没有由分离的切割步骤的需要带来的缺点。

因此，在第一方面，本发明提供了生产肽的方法，其中包括以下步骤：表达作为融合蛋白一部分的肽，接下来通过酰基受体如含硫还原剂从融合蛋白上释放肽。适当地，至少部分融合蛋白是能催化肽作为酰基部分转移给适当受体如近端硫原子以形成硫代-酯的分子。

在更优选的实施方案中，肽经过化学修饰，例如在从融合蛋白释放出来之后在其羧基末端酰胺化。适当地，酰胺化步骤在适当pH、一定来源的铵离子参与下进行并且酰胺化步骤与肽释放同时发生。可用这些方法制备的酰胺化肽的例子包括鲑降钙素、人降钙素、促黄体生成素释放激素、催产素、胃泌素神经肽Y、血管升压素、促肾上腺皮质素释放激素，生长激素释放激素、人降钙素基因相关肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素细胞刺激素前体、Sectetin、促甲状腺素释放激素、糊精、P物质、胰多肽、缩胆囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降压肽(Savagin)、肥大细胞脱粒肽M、雨蛙肽和FMRF酰胺。

然而，也可能在缺乏氨的情况下进行肽的简单水解，导致自由羧酸末端基团的形成。这使得本发明的方法适于进行用于医药或其它用途的带有自由羧基末端的肽的商业生产。这些肽的例子包括Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、脑肽(brain naturetic peptide)、心房肽(atrialnaturetic peptide)或杀菌/通透性-增加蛋白。

本发明的方法例如可利用设计用来制备作为融合蛋白的蛋白的、商业上可获得的表达载体。该载体包含修饰的自剪切蛋白即intein，使得可能通过简单的化学反应将蛋白从融合伴侣上释放出来。本发明利用修饰的化学条件/步骤以导致融合蛋白的切割从而释放所需要的能通过如羧基末端的酰胺化作用而得到修饰的肽。