[发明专利]稳定化后的人乳头瘤病毒制剂

说明书

相关申请的交叉参考

本申请是1997年4月8日提交的序列号为60/042,808的美国临时申请的部分延续。联邦资助研究的声明不适用缩微平片附录的参考不适用

发明领域

本发明涉及人乳头瘤病毒抗原制剂，该制剂表现出增强了的抗原稳定性和减弱了的抗原凝聚和沉淀性。本发明还涉及用此处公开的人乳头瘤病毒抗原制剂制备佐剂化HPV疫苗的方法。本发明还涉及由这些人乳头瘤病毒抗原制剂制备而成的佐剂化人乳头瘤病毒疫苗。

发明背景

乳头瘤病毒的感染发生在各种动物中，包括人、绵羊、狗、猫、兔、猴、蛇以及奶牛。乳头瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染部位形成良性上皮瘤和纤维上皮瘤。乳头瘤病毒是种特异性感染源。

根据所感染宿主的不同，乳头瘤病毒可以分为不同的组。根据DNA杂交研究，可以进一步将人乳头瘤病毒分为70多个型。PV的型之间表现出型特异性的免疫原，也就是说，对乳头瘤病毒的一个型引起的感染具有中和活性的免疫性不能赋予抵抗乳头瘤病毒另一个型的免疫力。

就人而言，不同的HPV类型引起的疾病不同。HPV的1、2、3、4、7、10以及26～29型在正常和免疫受损的个体中都能引起良性疣。HPV的5、8、9、12、14、15、17、19～25、36和46-50型在免疫受损的个体中能引起扁平损伤。HPV的6、11、34、39、41～44和51～55型引起生殖道和呼吸道黏膜非恶性湿疣。HPV的16、18、31、33、35、45和58型引起生殖道黏膜上皮发育异常，而且与大部分子宫颈、阴道、外阴、以及肛管的原位或侵袭性癌有关。

乳头瘤病毒是小的(50～60nm)、无囊膜、二十面体DNA病毒，由8个早期基因和2个晚期基因编码。病毒基因组的阅读框被命名为E1～E8以及L1和L2，此处的“E”代表早期而“L”代表晚期。L1和L2编码病毒的核衣壳蛋白。早期(E)基因与病毒的复制、翻译调节以及细胞转化有关。

L1蛋白是主要的衣壳蛋白，分子量为55～60kDa。L2是次要的衣壳蛋白，其预期分子量为55～60kDa，而通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量为75～100kDa。免疫学资料显示在病毒衣壳中，大部分的L2蛋白在L1蛋白的内层。L1的ORF在不同的乳头瘤病毒之间高度保守。L2蛋白在不同的乳头瘤病毒之间的保守性较低。

现在已经鉴定出L1和L2基因可以作为免疫预防的好的目标。另外还发现早期基因中的几个也可以作为发展疫苗的潜在目标。美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒(CRPV)和牛乳头瘤病毒(BPV)的研究表明，用重组L1和/或L2蛋白(用细菌或痘病毒载体生产的)免疫可以保护动物不受病毒的感染。用杆状病毒表达系统或痘病毒载体表达乳头瘤病毒L1基因可以导致病毒样颗粒(VLP)的组装，VLP能诱导产生高滴度的病毒中和抗体，这与保护个体不受病毒的攻击有关。而且，已经用L1和L2基因生产疫苗从而预防和治疗动物中的乳头瘤病毒感染。

现已在昆虫和哺乳动物细胞系统中表达了含HPV11L1蛋白的病毒样颗粒。酵母细胞中表达的VLPs具有成本划算和易于调节发酵罐中的大规模生长的优点。然而，酵母细胞中的HPV11L1蛋白的表达量低。观察到这种现象是由于HPV11L1 mRNA的截短导致的。相反，HPV6L1蛋白基因是全长mRNA翻译成的，其表达水平高。通过修饰HPV6L1DNA让其编码HPV11L1蛋白，这样就能促进全长mRNA的翻译导致HPV11L1蛋白表达量的增加。

现已用L1和L2基因来生产疫苗，预防和治疗动物中的乳头瘤病毒的感染。

把第16型的HPV的L1基因和L2基因克隆到痘病毒载体中，用重组后的载体感染CV-1哺乳动物细胞生产病毒样颗粒(VLP)。

已经生产出了细菌来源的重组牛乳头瘤病毒L1和L2。重组细菌蛋白的中和血清可以和天然的病毒之间低水平地交叉中和反应，这可能是由于天然蛋白和细菌来源的蛋白之间的构象不同。

现已用表达HPV16L1或HPV16L2 ORFs的重组杆状病毒感染SF9细胞，生产L1和L2蛋白。Western印迹分析表明，杆状病毒来源的L1蛋白和L2蛋白能与HPV16的抗体交叉反应。该杆状病毒来源的L1可以形成VLPs。

Jansen等人(1995，Vaccine 13(16)：1509～1514)在从美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒纯化L1和L1+L2 VLPs的过程中，使用了含有氯化钠和Tween80^的电泳缓冲液。