[发明专利]植物GRAB蛋白

说明书

本发明涉及：控制植物细胞周期的方法，特别是为了控制植物细胞和植物病毒生长和/或复制、分化、发育和/或衰老的目的；在这样的方法中使用以前未鉴定和/或未分离的蛋白和/或核酸；在这样的方法中使用以前天然功能未知的已知蛋白或核酸；未鉴定和/或未分离的蛋白和核酸本身以及它们的浓缩、分离、无细胞和/或重组形式；以及包含这样的重组核酸的植物。

已经有许多文件证明病毒复制循环在被感染细胞内的成功完成通常需要细胞因子的参与。这在具有仅编码几个蛋白的小基因组的病毒的情况下特别明显。例如，动物DNA肿瘤病毒利用细胞机器进行它们的转录过程和DNA复制过程。此外，已经有一个或多个病毒编码蛋白演化出来，这些蛋白直接冲击被感染细胞的细胞生理以创造一个适于病毒复制的细胞环境。一个典型的例子是由动物DNA肿瘤病毒编码的癌蛋白，即SV40 T抗原、腺病毒E1A或人乳头瘤病毒E7蛋白，这些蛋白通过干扰成视网膜细胞瘤途径而激活被感染细胞的细胞周期(26，28，45)。

相似的策略看起来已经在植物双生病毒(一群独特的植物DNA病毒)中演化出来。根据不同的亚群，双生病毒基因组包含1或2个小型(2.6-3.0kb)环状单链DNA分子(11，24)。小麦矮双生病毒(WDV)属于亚群I，亚群I的成员具有最小的基因组，即一个单个的长2750个核苷酸的单链DNA分子，仅编码几种蛋白。在这些蛋白中，只有RepA(又称C1)和Rep(又称C1∶C2)是病毒转录和复制所需的WDV蛋白(24)。RepA由单一转录物上翻译得到，其中所述转录物在互补义(complementary-sense)启动子的控制下产生。该mRNA经过剪接后，产生了Rep蛋白(37)。WDV Rep是病毒DNA复制所绝对必需的，并且与所有双生病毒的Rep蛋白同源。已经显示双生病毒的Rep蛋白具有体外DNA切口连接活性、复制起点识别能力和ATP酶活性。然而，RepA蛋白是WDV双生病毒亚群所独有的，并且已经暗示其调节与Rep活性、结合植物成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白(45，46)以及刺激病毒粒意义(virion-sense)的基因表达有关。此外，最近我们展示了在WDV中，Rb结合蛋白(RepA)与起始子蛋白(Rep)在病毒DNA复制中起协同作用。

双生病毒DNA复制在被感染细胞的核内发生，并且由于缺乏病毒基因组编码的复制酶，病毒DNA的复制需要S期的功能。与此相一致的是复制中间体在S期的核中的积累(1)。双生病毒通常感染非增殖细胞，但有趣的是，它们诱导S期典型的细胞蛋白出现，如增殖细胞核抗原(PCNA)(29)，而这种蛋白在其它情况下在非增殖细胞中是检测不到的。亚群I双生病毒如WDV，编码参与双生病毒冲击细胞周期激活回路的机制的蛋白，这些蛋白包含一个在RepA蛋白中介导蛋白与Rb相互作用的能力的LXCXE基序(45)。这些观察提供了分离全长cDNA编码的ZmRb1(一种植物Rb蛋白)的基础，其中所述ZmRb1可以在植物细胞中作为一种G1/S转变的调节物(46)。与这种功能相一致，在培养的植物细胞中植物Rb(以及人Rb)的超量表达显著抑制WDV的DNA复制(45，46)。因此，看起来双生病毒用于促进DNA复制的机制中的至少一种机制，通过螯合Rb并因此干扰Rb的负反细胞生长活性(negative cell growth activity)，成为被感染细胞中S期的触机。

植物中细胞周期、细胞生长和分化的调节是调节物的复杂的相互作用的结果，所述调节物的活性是对广泛种类信号的应答，所述信号如激素、营养可得性或环境条件(20，39)。例如，D型细胞周期蛋白mRNA的水平迅速提高以应答蔗糖或细胞分裂素处理(41)，而依赖于细胞周期蛋白的激酶(cdc2)mRNA的水平依赖于生长素的存在。其它植物细胞周期调节物的分子本质以及它们与细胞生长和分化相关的功能还是大部分未知的。因此，鉴定参与这些控制途径的细胞因子以阐明决定植物细胞对生长信号的应答的分子机制是非常重要的。

由于细胞因子对于完成双生病毒复制是绝对必需的，所以本发明人推测，双生病毒可能通过干扰Rb途径的机制以外的机制来调控细胞生理，并且这样的效应可能是双生病毒蛋白将目前未知的细胞因子作为目标的结果。他们使用了一种实验策略，以鉴定与RepA(WDV的Rb结合蛋白)功能性相互作用的蛋白，并且现在已经提供了几个编码以前未鉴定的蛋白的cDNA克隆并确定了它们的功能。