[发明专利]生物样品中生物分子的噬菌体检测法

说明书

本发明涉及一种用于检测生物材料中是否存在目的分子的方法。该方法是为了解决许多科学研究领域中的一种常见需要。实际上，能够鉴定生物样品中是否存在与例如临床病理学相关的分子，一直是研究工作，特别是在医药领域中的一个重要目标。

毫无疑问，生物医学领域是该方法的主要(尽管不是唯一的)应用领域。实际上已提出了一些涉及此类方法的申请，其目的在于逐渐提高检测的灵敏度，特别是达到诊断水平。

最常用于检测细胞或组织提取物中是否存在特异分子的生物化学手段是抗体，这是因为它们具有极好的灵敏度和较高的结合特异性。

当这些方法中与目的分子发生了相互作用时，可以用与抗体自身相连的标记物(例如荧光物质、具有酶活性的蛋白质或放射标记物)来使之显现。

已发现，在所有情况中通过使用所谓的信号放大方法可以显著增强这些标记物的检测能力。用这些标记物，例如通过将标记物与能结合第一个抗体(初级抗体)的第二个抗体(次级抗体)，而非与用来进行特异识别的抗体(初级抗体)连接在一起，能获得更强的检测信号。已建立了利用次级抗体的许多方法，其中次级抗体共价键连接了某些标记物分子，例如荧光物质(比如荧光素或诺丹明)、具有酶活性的蛋白质(比如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，在用电子显微镜进行检测的情况中，还可使用铁蛋白或胶体金球体。

可替代的放大系统利用了分子的高结合亲和力，比如生物素(一种小的水溶性维生素)和链霉抗生物素蛋白(细菌蛋白质)之间的亲和力，或者卵磷脂(能识别并结合特异糖基的蛋白质)和糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖等分子之间的亲和力。

在这一基本构思上可以做非常广泛的改动，包括那些导致形成标记物网、能相当大地放大检测信号的改动。无论如何，所有这些方法都与抗体作为能特异识别目标分子的分子这一用途相关，并且它们的灵敏度也受到目标分子浓度的限制。

最近设计的一些方法可以克服后一种限制，这些方法基于运用PCR(聚合酶链反应)技术来代替酶检测法。实际上它们也是基于单克隆抗体能够抗特异配体的用途，但是在这种情况中，所述配体不是与蛋白质、而是与序列已知的多核苷酸以物理方法偶联在一起的。

这样就可以采用聚合酶链反应(PCR)有效地扩增已知DNA序列进行随后的检测(V.Ruzicka等，1993；T.Sano等，1992；H.Zhou等，1993)。

这种称为免疫PCR的方法，实际上甚至能检测到与目标分子结合的单个抗体。这些方法灵敏度有了相当的提高，但引发了一系列问题，其中包括多核苷酸与抗体的直接连接，以及抗体与目标分子结合过程中多核苷酸带来的无法避免的干扰所导致的高背景。

另外，考虑到扩增反应的特异性以及产量要取决于混合试剂时的温度，如果在低于引物杂交最佳温度的温度下进行PCR反应，就有可能产生非特异性的杂交产物。

通过仅在体系已经达到“热启动”(“Hot Start”)引物能特异杂交的温度，才向扩增反应加入关键试剂，目前这个问题已得以解决。通过机械地隔离一种试剂(D.E.Birch等，1996)或者用抗体封闭DNA聚合酶的酶活性(J.Cheng等，1996)可以实现这个步骤。

近来，还建立了一种在细胞上进行的PCR方法，称为原位PCR(G.J.Nuovo，1994)，这种方法是在原位杂交反应之后进行扩增。根据这种方法，要将DNA模板和引物保持物理隔离直至细胞发生裂解之时，其优点是避免了任何非特异杂交反应(EP24808 Hoffmann La RocheInc.)。

另外，有一系列专利都涉及新的诊断方法，这些方法预期能克服现有方法的许多常见问题，从而可提高反应信号的扩增。这些专利含有多种以此为主题的方法，比如利用与发现特定蛋白质相关的PCR(WO9421676)；利用与配体(例如HIV-1病毒的表位)偶联的基因工程化杂合酶(WO942636)；利用由抗原结合蛋白所结合的核酸制备的病毒表位(WO9406934)；利用部分病毒cDNA(例如取自HCV的cDNA)来表达与调控序列有关的病毒表位和针对该表位的单克隆抗体。在后一种情况中，目的cDNA区使得能够在抗体应答以及与DNA杂交后的反应之间进行交互参照(EP388232)。

另外一项专利，与此不同，其主题是构建抗原决定区文库，这是用DNA酶-I消化病毒(例如HIV)基因组，之后采用合适的载体来表达这些片段，然后利用抗体挑选出所述表达产物而获得的(EP373070)。